样品制备
样品制备是 HPLC 分析的一项重要内容，目的是提供适合注入色谱柱的有代表性的、可重现的、均匀溶液。样品制备需使样品溶液达到以下要求：
(a) 无干扰，
(b) 不损坏色谱柱，
(c) 与 HPLC 分离和检测方法相匹配。还可以对分析物进一步浓缩和/或衍生，以提高检测灵敏度或改善分离。
样品制备是从样品采集开始，直至进样到 HPLC 柱中，包括样品采集、运输、保存、前处理、实验室取样和后续的称量/稀释，以上构成了样品制备的重要部分。这些步骤对 HPLC 分析方法的准确度、精密度和便利性有着关键性的影响。
样品过滤可以延长柱寿命。较小色谱柱的筛板更容易堵塞，因为随着色谱柱填料粒径的降低，筛板尺寸也相应减小。5 μm 或 3.5 μm 色谱柱用的是 2 μm 筛板，2-3 μm 色谱柱用 0.5 μm 筛板，而 1.8 μm 柱则用 0.3-0.5 μm 筛板。填料粒径越小，样品过滤就变得越重要。
过滤流动相将减少仪器部件的磨损，如单向阀、活塞密封垫以及自动进样器的柱塞杆和针头。同时也有助于避免毛细管管路的堵塞。
样品过滤有助于降低对检测器的污染。例如，在质谱检测器中，蒸干溶剂后，非挥发物和颗粒将沉积下来。
去除基质干扰和“色谱柱危险物”
浓缩或痕量分析物的富集
除盐
溶剂更换（或溶剂切换）
原位衍生
在水中的溶解度低（<10%）。
具有挥发性，萃取后易于去除并浓缩。
与分析所用的 HPLC 检测技术兼容（避免使用具有强 UV 吸收的溶剂）。
极性和氢键性质能够提高分析物在有机相中的回收率。
高纯度，最大限度地减少样品污染。
使用两种不同相存在的主要问题就是可能发生乳化现象。两种互不相溶的相没有回到各自的液体层内，而是在彼此间以悬浊状态存在。可以使用固相支持的液液萃取或称为 SLE，避免乳化的发生。
使用高纯度级别溶剂的重要性
一般来讲，HPLC 应用中只应使用色谱级及以上级别的溶剂。过滤所有缓冲液。最好使用 0.22 μm 滤膜，特别是对于 UHPLC 应用，标准 HPLC 应用可使用 0.45 μm 滤膜。色谱级及以上的有机溶剂一般不需要过滤，如果过滤使用的滤膜和玻璃容器不是色谱级的，过滤反而可能带来污染物。
记住，要适当冲洗色谱柱。一天分析结束时，将缓冲液从系统中冲洗出去，使其处于水/有机流动相环境。使用与样品溶剂相溶的流动相（参见本指南封底的参考流程）。如果流动相 A 只用水或最多 5% 乙醇，将其留在系统中较长一段时间后，将会长菌。
这将带来压力问题，并很难去除，因此，一定要确保每天或至少每两天新配缓冲液。
使用高纯度级别溶剂的重要性
由于高效柱中填料粒径太小，色谱柱两端需要用更小的筛板阻挡它们。同时筛板也能起到阻止颗粒物进入系统的作用，避免引起压力升高。所以，对于更高压力的 UHPLC 应用而言，防止污染物进入系统变得更为重要。
在 UHPLC 应用中只使用认证的色谱/质谱级溶剂。一定要检查溶剂供应商是否提供以下证书：
低溶剂和金属杂质，以减少对痕量或未知样品的干扰
痕量金属指标极低 – 不超过 5 ppb
正离子模式和负离子模式性能指标
LC-MS 测试和其它 QC 测试（QC 测试项目越多，溶剂越好！
溶剂使用提示：
对于高压操作，不锈钢溶剂过滤头比玻璃头更好，因为它们更为耐用。
使用缓冲液将提高堵塞的风险，如果需要使用缓冲液，应用玻璃过滤头，将细菌生长的可能降至最低。
一定要小心混合改性剂，使用常用浓度。
使用窄径柱时，每次分析所需的溶剂量较少。一定要经常更换缓冲液，尽可能保持溶剂新鲜。
把未用的溶剂放入冰箱，并每天更换。
在线过滤器与保护柱
在线过滤器，在自动进样器和色谱柱之间安装在线过滤器。可以捕集颗粒物，防止其流入柱头，阻塞筛板。如果您使用的是 3.5 μm 柱，应配置 2 μm 筛板。1.8 μm 柱使用 0.5 μm 筛板。
保护柱，脏样品多次进样到不带保护柱的分析柱上时，会缩短分析柱的寿命。根据进样次数和样品类型，色谱工作者可选择经济的保护柱。
保护柱避免了由颗粒物和强吸附物质造成的损坏。为保持对样品杂质有足够的容量，应选择内径与色谱柱内径相似的保护柱。理想情况下，保护柱的填料应与分析柱相同，从而使分析柱的色谱性能不发生改变。保护柱参与分离，因此在方法开发时就应在线安装保护柱。
判断何时更换保护柱可能比较困难，最好根据经验。如果说作为粗略判断标准的话，那么塔板数、压力或分离度的改变超过 10%，就需要更换保护柱了。您需要根据应用类型对更换保护柱的频率做出判断。尽早更换保护柱总比晚更换好。
色谱柱保护和保存
使用保护柱和/或 0.5 μm 在线过滤器
经常用强溶剂冲洗色谱柱。使用 100% B 溶剂，如果怀疑压力升高，使用更强溶剂。
对“脏”样品进行预处理，最大限度减少强保留组分和颗粒。使用固相萃取、液-液萃取、用 0.45 μm 滤膜（UHPLC 用 0.22μm 滤膜）过滤样品，或高速离心。
按照色谱柱生产商的温度上限指标进行操作。许多新方法都要求较高温度，某些色谱柱可以承受高温，理想情况下，应在温度上限指标之下操作色谱柱。
在压力上限之下使用色谱柱。选择使压力低于压力上限的流速，最好低 10%。
按标注方向操作色谱柱，查阅色谱柱说明书或咨询厂商，以确定色谱柱是否可以反冲。如果您有问题，一定要询问厂商。
使用 pH 2-7 的流动相，可最大限度地延长柱寿命。如果您需要在超过此 pH 范围的条件下工作
使用新鲜溶剂，以防止细菌生长。为防止细菌生长，可配制流动相贮备液，并将其保存在冰箱中，需要时每天使用。用叠氮钠也可以防止细菌生长，但其具有致癌性，须小心使用。
贮存色谱柱时，应先冲出盐和缓冲液。柱内只保留纯乙腈，或纯水与乙腈 50/50 混合溶剂。这样可以防止缓冲盐在柱内沉淀。乙腈是色谱柱保存的良好溶剂，因为水和醇类流动相可能提高固定相水解速率。
使用高温时一定要逐渐升高柱温，而且仅在用流动相洗脱时进行。分析完成后，让流动相继续洗脱，直到回到室温。
色谱柱接入仪器时，两端接头不要拧得过紧。使用短柄扳手，以防两端接头过紧。由于色谱柱的柱端螺母为 3/8 英寸，应使用 3/8 英寸短扳手将色谱柱接入仪器，不要将柱端接头拧得过紧。
确保方法的重现
如果色谱柱的使用背景不同那么它们的保留就很可能不一样，如果在方法开发时使用的色谱柱被另一根色谱柱代替，那么将会产生不同的结果。这是由于第二根色谱柱可能没有经历过与第一根柱相似的使用背景。
在开发方法的过程中，可能存在平衡不足或不一致的情况，又没有给重复实验的其他工作人员明确的提示。每个工作人员平衡其色谱柱的时间可能不同，很可能使结果产生波动。当采用与方法开发人员相同的方式平衡色谱柱后，将得到相同的结果。
引起保留改变的其它因素包括，由于方法可能不耐用，导致色谱柱/流动相组合不好；流动相、流速以及其它仪器参数发生改变；以及色谱柱之间柱床体积略有不同等。
消除引起柱间选择性改变的全部因素
重新评估方法耐用性，并修改方法
测定 pH 敏感性，并再次修改方法
将不同的选择性变化分类，并联系生产厂商
有关驻留体积
驻留体积与实验室之间的方法转移密切相关。如果一个实验室中使用的 HPLC 仪器与另一个实验室仪器的驻留体积不同，即使两个实验室使用相同的方法，运行结果也很有可能不完全相同。这种不匹配的原因就在于在两种（或更多）流动相混合形成梯度后，经仪器管路到达柱头的时间不同。因此，分析物进样后，将通过不同的流动相组成（时间的函数）进行分离，其保留和分离度都可能受到影响。所以，应对驻留体积较小的仪器增加体积来调整驻留体积。或者，减少驻留体积大的仪器的管线内径和长度，使其与驻留体积小的仪器相匹配。另一个“办法”是在方法中设置一段梯度延迟，对流路系统中不同的驻留时间进行补偿。但是，某些认证方法可能不允许分析中使用这种改变。
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