图解病理染色｜第6期. 一文吃透免疫荧光染色，看这篇就够了！
文摘
科学
2024-07-01 21:49
北京
原理：免疫荧光（immunofluorescence,IF）可以将抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体作为探针，检测细胞或组织内的相应抗原（靶蛋白）。利用荧光显微镜观测荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原的性质和定位。本期我们将详细介绍组织石蜡切片免疫荧光染色的实验步骤、注意事项和图解示例。
整体来说，IF染色的制备过程涉及8大步骤：脱蜡至水 → 过氧化氢通透 → 抗原修复 → 羊血清封闭 → 一抗孵育 → 复温 → 二抗孵育 → 封片。下面我们来看每一个具体的步骤~
（1）步骤：55℃烘箱中烤片30min后，依次将切片放入二甲苯（5minx3次），无水乙醇（5 minx3次），95%乙醇（5 minx1次），70%乙醇（5 minx1次），双蒸水冲洗（5min）。
（2）目的：脱去石蜡，并使样本达到适当的水分含量，便于后续染色。
（1）步骤：切片浸泡于3% H2O2中15 min，在PBS中清洗，3次x5min（摇床）。
（2）目的：去除内源性过氧化物酶。
（1）步骤：组织切片置于柠檬酸盐修复液(PH6.0)中，于高压锅内进行抗原修复，水沸后计时5分钟，取出后自然冷却至室温。在PBS中清洗，3次x5min（摇床）。
（2）原因：石蜡切片标本均用甲醛固定，封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
（3）目的：恢复抗原的原有空间形态。
（1）步骤：用10%羊血清室温封闭至少40min（置于摇床）。
（2）目的：封闭非特异性抗原。
（1）步骤：弃去液体，每个组织滴加30 μL稀释后的抗体溶液，放于湿盒中 4 ℃过夜。
（1）步骤：切片浸泡于3% H2O2中15 min，在PBS中清洗，3次x5min（摇床）。
（2）目的：去除内源性过氧化物酶。
（1）步骤：滴加20 μL稀释后的荧光二抗溶液，37 ℃孵育1 h。弃去二抗，PBS清洗，3次x5min（摇床）。
（1）步骤：用含有 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭剂的封片液进行封片。后续使用荧光显微镜进行图片采集。
总结：免疫荧光染色流程图
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染色显示：DAPI染细胞核为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。
数据分析：通过IF染色可以确定蛋白表达位置，推算蛋白表达量。通过Image J软件测量阳性细胞占比或阳性面积占比等，使用Graphad Prism作图。
具体方法可以参考B站“开心doctor”视频介绍临床医生科研作图—13.1HC图片拼接、数据转 化、统计作图
图中展示了心肌组织梗死区石蜡切片IF染色情况，定位到巨噬细胞核内。
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原文图注：K and L, Immunofluorescence co-staining for F4/80 (red) with Pan Kla or H3K18la (green) in infarcted hearts 3 days post-MI, scale bar=40 µm, n=6.
原文描述：In line herewith, immunofluorescence staining of infarcted hearts 3 days post-MI showed significantly increased levels of global lactylation and H3K18la and merged confocal images revealed that lactylation was localized in the nuclei of macrophages in the infarcted region (Figure 2K and 2L).
这就是本期的全部内容啦！不知道这样的展示方式是否能帮助到你？也特别欢迎大家给我们多多留言，希望我们能一起成长，共同进步！下一期介绍免疫组织化学染色的具体步骤和图解分析，敬请期待！
参考文献：Wang N, Wang W, Wang X, et al. Histone Lactylation Boosts Reparative Gene Activation Post-Myocardial Infarction. Circ Res. 2022;131(11):893-908. doi:10.1161/CIRCRESAHA.122.320488
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