单细胞思路系列如约进行！整体而言有寻找发病机制、图谱研究、分子功能研究、诊断或预测标志物研究几大类，上一期分享的主要是从单细胞的图谱类研究。本期则给大家分享的单细胞思路是：通过单细胞测序研究分子功能。
我们一般情况下研究靶点分子的功能可能是通过过表达或敲低/敲除之后，看我们预期表型的变化，其实还有一种更具有说服力的方法，就是在过表达或敲低/敲除之后与WT组同时进行相应的测序，可以从两组差异基因等更为宏观的层面去说明变化。
文献一:Nature Cell Biology IF =17.3
Nature cell biology vol. 24,5 (2022): 672-684.doi:10.1038/s41556-022-00901-3
ETV2 functions as a pioneer factor to regulate and reprogram the endothelial lineage
本文想要说明ETV2这个分子在促进胚胎成纤维细胞（MEFs）的reprogramming过程中表达内皮细胞基因的机制。![]()
图一 过表达ETV2后scRNAseq + bulk ATACseq测序
首先进行在过表达ETV2（是通过基因编辑小鼠给予Dox实现）后不同时间点的scRNA-seq以及ATAC测序（a图），最终说明诱导ETV2后会有一群高表达内皮marker的cluster出现（d图的1、3群），并且根据双组学找到13个可及性增加并且表达增加到转录因子（i图）。后面作者通过靶向ETV2进行Chip-seq寻找其作用靶点，此处不再赘述。前期研究证明BRG1可能在先锋因子引起染色质重塑过程中发挥重要作用，因此此处作者开始证明另一个ETV2是通过与BRG1相互作用而影响染色质开放性的。首先有BRG1 Chip-seq的结果，证明和ETV2的重合，其次通过sh RNA在MEF诱导ETV2表达前48小时敲低Brg1，然后在不同的时间点进行scRNA-seq以及ATAC-seq。结果显示敲低Brg1对MEF细胞增殖产生影响、内皮关键内皮基因的表达水平降低等（图二c-f）。ATAC结果显示敲低Brg1影响了ETV2在染色质上的结合（图三a）。
可以发现本文作者对于关键的两个分子，一个（ETV2）进行过表达后测序证明其在染色质重塑中的作用，一个（BRG1）进行敲低后测序证明其在重塑中必不可少。最终说明ETV2能够作为“先锋转录因子”，与核小体DNA结合并招募BRG1，从而增加内皮基因周围的染色质开放状态，增加了H3K27ac的沉积，影响内皮细胞的发育。可以说测序在作者的论证中发挥了重要作用。如果想要看详细的原文解析大家可以点击链接去学习！Nat Cell Biol｜学习经典文献如何说明一个分子的作用！
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文献二：Nature Immunity IF =27.8
Nature immunology vol. 25,8 (2024): 1395-1410.
doi:10.1038/s41590-024-01901-1
BACH2 regulates diversification of regulatory and proinflammatory chromatin states in TH17 cells
这一篇文献涉及的领域是免疫领域。本文主要通过scATAC-seq、scRNA-seq等测序宏观阐述了非致病性TH17（npTH17）细胞和介导组织炎症的致病性TH17（pTH17）细胞之间的差异以及调控网络，并预测出调节TH17细胞致病性的转录因子—BACH2。如何验证BACH2的作用呢，作者也是采用的敲除BACH2后再测序的方法，发现npTH17细胞中促炎细胞因子IL-17A、IFNγ和GM-CSF的表达增加，pTH17和npTH17细胞均向更具TH1细胞特征的染色质谱转变，这表明BACH2在TH17细胞中限制了TH1细胞程序（图三b–d），并且EAE（自身免疫性脑脊髓炎）疾病相关表型加重（图三e-g），由此说明BACH2作为TH17细胞致病性的负调节因子。
原文：Bulk ATAC-seq analysis of Bach2 KO and control npTH17, pTH17 and TH1 cells revealed a shift of both pTH17 and npTH17 cells toward a more TH1 cell-like chromatin profile, suggesting that BACH2 restricts the TH1 cell program in TH17 cells.![]()
文献三：Signal Transduction and Targeted Therapy IF =40.8
Signal transduction and targeted therapy vol. 9,1 94. 22 Apr. 2024doi:10.1038/s41392-024-01804-5
PBX/Knotted 1 homeobox-2 (PKNOX2) is a novel regulator of myocardial fibrosis
该研究通过sc RNA-seq发现PKNOX2在成纤维细胞激活到病理性肌成纤维细胞形成的过程中异常减少，并通过基础实验验证PKNOX2在心脏病理性纤维化中的作用。在此基础上，作者通过腺病毒递送质粒感染成纤维细胞系，并进行bulk-seq测序，通路富集分析显示下调的基因与细胞外基质组织、间充质细胞分化和胶原纤维组织相关，而上调的基因则与细胞增殖相关（图4e, f）。
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图五 过表达Pknkx2后RNA-seq
总结一下，在前期分析找到一个分子靶点基础上进行过表达或者敲除/敲低之后再进行测序可以从生信角度去说明相关分子在所研究疾病/表型的中的作用，并且例如Bulk Rna-seq的价格已经比较低，是我们未来实验设计都可以考虑的一个方向，大家学会了吗！
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