撰文│康 岚
编辑│毕紫娟
审校│汤红明
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在有性繁殖的高等生物个体发育中，生殖细胞发育也称配子发生，是独立于体细胞谱系发生的特殊过程，生殖细胞经历减数分裂，使得一个细胞中的染色体含量减半，再经由两个配子的结合恢复一个新生物的完整染色体数量，由此开启一个新的生命周期，使种族的生命得以延续。过去数十年，人们基于配子发育机制的探索，在利用多能干细胞体外重建生殖细胞方面取得了长足进步，小鼠多能干细胞可以诱导分化成为功能性卵母细胞和精子，而人类多能干细胞可以诱导分化成早期卵母细胞和前精原细胞，这些进展促进了对哺乳动物生殖细胞发育机制的理解，也为未来的生殖医学及不孕症机制探索和个体化治疗带来更多可能性。
多数动物的生殖细胞来源于原始生殖细胞（primordial germ cell，PGC），这些细胞被认为由发育早期继承了卵母细胞中的生殖质特化而来，生殖质中的蛋白质和RNA（如Vasa、Piwi、Nanos、Tudor、Pumilio等）通过调节基因表达，主要是抑制基因表达，参与决定生殖细胞的特化。在大多动物中，PGC与生殖腺具有不同的发育起源，位置上也有一定距离，在生殖腺原基发生时，不同动物的原生殖细胞以不同迁移方式进入生殖腺原基，并在那里进行生殖细胞的分化，由其所驻留的生殖腺决定其最终分化为精子或者卵子。在雌性个体中，减数分裂在胚胎的生殖腺中开始，而在雄性个体中，减数分裂直到青春期才启动。
当哺乳动物的PGC到达雄性胚胎生殖腺后，分裂形成精原细胞A1（type A1 spermatonium），该细胞是具有自我更新能力的精原干细胞，分裂形成精原细胞A1和精原细胞A2，后者经两次分裂形成精原细胞A3和A4。精原细胞A4再经两次分裂成为过渡性精原细胞和初级精母细胞，初级精母细胞将进入减数分裂，第一次减数分裂形成次级精母细胞，第二次减数分裂形成单倍体的精子细胞，继而分化为成熟精子。精子发生受到一系列激素调控，下丘脑分泌促性腺激素释放激素作用于垂体，使后者分泌促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）和促黄体生成素（luteneizing hormone，LH），LH作用于生精小管之间的间质细胞，使其合成睾酮，通过扩散进入生精小管，刺激精子发生。哺乳动物的卵子发生与精子发生有较大差异。在胚胎期，到达卵巢的PGC在胚胎期迅速分裂增殖，产生大量卵原细胞，但是大部分都在不久后死亡，存活下来的卵原细胞在视黄酸的作用下继续发育并启动第一次减数分裂，形成初级卵母细胞，并停滞于第一次减数分裂的双线期，每个卵母细胞由颗粒细胞和膜细胞包裹形成卵泡。进入青春期后，下丘脑释放垂体促性腺释放因子，继而促进垂体分泌FSH和LH。FSH促进卵母细胞生长发育，FSH和LH共同促进滤泡细胞释放雌激素，促进卵泡生长，雌激素调控减少FSH水平并增加LH分泌量， 在高水平LH刺激下初级卵母细胞恢复并完成第一次减数分裂，进入第二次减数分裂中期，形成一个极体和透明带包被的次级卵母细胞，也叫MII卵母细胞，与此同时，卵泡成熟并启动排卵，次级卵母细胞在受精发生时才恢复并完成第二次减数分裂排出第二极体，继而与单倍体的精子融合形成二倍体的合子，开启个体发育。在小鼠发育过程中，胚胎期第6.5天（E6.5）左右的部分上胚层细胞，通过响应骨形态发生蛋白4（BMP4）信号，激活下游WNT3信号，最终分化为小鼠PGC。源于囊胚内细胞团的小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）处于原始态，可以通过与胚胎嵌合发育分化到个体所有细胞类型，包括生殖细胞；而来源于E5.5到E6.5植入后上胚层的小鼠上胚层干细胞（epiblast stem cell，EpiSC）处于始发态，虽然表现出与E6.5之后上胚层相似的特性，却难以分化为生殖细胞。因此，人们探索了利用激活素和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）诱导小鼠ESC分化为对应E5.5到E6.0上胚层的上胚层样细胞（epiblast-like cell，EpiLC）的策略。小鼠EpiLC在BMP4信号刺激下，可迅速分化为类似体内迁移阶段的PGC样细胞（primordial germ cell-like cell，PGCLC），它们在体内合适的环境下能够参与精子/卵子生成，并产生可繁殖的后代。PGCLC可与胚胎睾丸体细胞共培养形成重组睾丸，通过这种方式可以诱导出与体内生殖干细胞（germline stem cell，GSC）类似的生殖干细胞样细胞（GSCLC），后者在移植到成体睾丸中后可产生功能性精子。更有研究利用ESC来源的PGCLC与新生小鼠睾丸体细胞共培养，并在形态素和性激素的刺激下，可再现减数分裂的关键特征，如遗传印记的擦除、染色体突触和同源重组，产生核DNA和染色体含量正常的单倍体细胞，将得到的圆形精子样细胞注入卵母细胞内，可以产生健康、可育的后代。通过体外重组卵巢，PGCLC可以顺利进入减数分裂分化为卵母细胞，继而通过体外生长和成熟诱导成为MII卵母细胞，由小鼠ESC和iPSC诱导得到的MII卵母细胞均可受精获得后代。然而，体外分化获得的卵母细胞质量还有很大的提升空间，其同源重组错配率较高，线粒体DNA含量较低，经过受精获得正常子代的发育率远远低于体内发育的卵母细胞。
体外分化体系在阐明生殖细胞发育的关键机制方面发挥了重要作用。由于体内发育过程难于观察和人工操作，生殖细胞发育的关键因子研究很大程度上依赖于条件敲除小鼠，然而这一策略又受限于是否存在特异性的启动子，要细致分析发育各阶段机制则更为困难。ESC的可操作性以及体外系统的可及性使解决这些问题成为可能，优化的分化体系逐渐实现体内发育事件的体外重建，获得对应于体内各阶段的细胞，并提供了一个有力的平台实现关键因子的筛选。小鼠配子体外分化的成功为人的配子发生研究提出了新可能。2015年，Surani团队在4i（添加分别针对MEK、GSK3b、p38和JNK的抑制剂）体系中培养的人PSC可以由BMP信号诱导到人PGCLC；Saitou课题组则发现在常规条件下培养的人PSC可以先被诱导到早期中胚层样细胞（incipient mesoderm like cell，iMeLC），继而由BMP信号诱导为hPGCLC，两项研究获得的人PGCLC均显示出与早期人PGC相似的基因表达谱。在之后的研究中，Saitou课题组将人PGCLC与小鼠胚胎卵巢体细胞共同聚集培养形成异种重组卵巢，成功实现了将人PGCLC诱导成为人卵原细胞，激活Dazl、Ddx4 等关键基因，并且经历了全基因组DNA去甲基化、印记擦除、X染色体再激活等关键分子事件。类似的策略也应用在雄性配子分化上，通过与小鼠胚胎睾丸体细胞聚集培养可将人PGCLC分化到类似体内静息期的前精原细胞状态。伴随近几十年干细胞基础研究和临床应用的高速发展，体外配子发生领域受到越来越多的重视并走到了机遇与挑战并存的时代。虽然还未有人体外分化类精子细胞的报道，但近几年不断涌现的成果使大家对于成功完成人及其他物种的配子体外分化充满信心，同时也让领域专家对分化系统提出了更高要求。现在使用的异种细胞共培养系统是不理想的，物种差异可能是妨碍人类配子发生的因素之一，虽然人类胎儿或新生儿性腺体细胞的使用可能极大地提高配子发生的成功率，但是却带来更大的伦理挑战。因此将PSC诱导到分化体系中需要的体细胞可能从根本上解决这些问题，这一策略在小鼠卵子发生体系中已经得到了验证。在这一体系基础上，优化人PSC分化为性腺体细胞的体系，继而提供更好的配子发生条件，相信会极大推进人配子发生的研究。
虽然体外配子发生为不孕不育症及儿童肿瘤患者的生育力保存创造了新可能，但在现有科学伦理体系下很难被接受。配子是担负特殊使命的细胞，经过复杂的体外操作产生的配子及其后代可能存在大量未知问题，这些问题对人类种系造成的影响也是难以想象的。因此，即使未来体外分化获得配子得以应用，所使用的配子也必须是极为正常的，而这里的“正常”本身可能也是现有的知识未能充分阐释的。研究人员可能从形态、基因表达、表观遗传特征等方面看到体外获得的类配子与体内的配子极为相似，但实际上从这些细胞得到的胚胎发育率却远低于体内发生的配子，更不用说出生后代在健康、寿命、行为、精神等方面可能存在的问题，这些在人类个体上的严重问题在小鼠这样的模式动物上却常常难以体现。提高配子质量的体系优化离不开功能验证，但同样出于伦理问题，人配子诱导无法进行功能探讨。因此，未来针对非人灵长类动物的体内外配子发生研究一方面能为人配子发育和分化提供非常重要的理论线索，另一方面在评判和不断优化体外分化配子质量的问题上发挥关键作用。
干细胞技术常被认为是细胞生物学领域应用科学的重要组成部分，干细胞分化并应用于临床疾病治疗是其最大的价值，然而在干细胞来源的体外配子发生领域，这种临床应用在短时间内难以企及。即便如此，生物体内这一过程的复杂和优美都吸引着科学家竭尽全力去复刻并理解它，而对哺乳动物生殖细胞发育机制的深入理解，也将为未来的生殖医学及不孕症机制探索和个体化治疗带来更多可能性。
