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彭倩
dNTP是deoxy-ribonucleoside triphosphate（脱氧核糖核苷三磷酸）的缩写，是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C等中的一种。在生物DNA合成中，以及各种PCR（RT-PCR（reverse transcription PCR）、Real-time PCR）中起原料作用。这些化合物属于大极性化合物，常规的反相色谱柱通常难以保留，而使用离子对试剂，方法的耐用性会受到挑战。
Hypercarb 填料为100% 的多孔石墨化碳（PGC），球形全多孔颗粒。碳原子排列成六边形为骨架的多片层结构，因此，填料表面为纯晶状结构，没有任何其它的亚孔或键合相。基于这一特点，Hypercarb色谱柱具有不同于硅胶基质固定相的独特性质。Hypercarb 对各种流动相溶剂都表现出极佳的稳定性，pH 在 1-14 之间的流动相皆可用于分离。基于Hypercarb 独特的疏水和电子云保留机理，它非常适合解决反相和正相 HPLC 及 LC/MS 应用中的“高挑战样品”分离，能够以超凡能力保留强极性目标物并分离结构性质接近的化合物。
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本文采用黑科技Hypercarb色谱柱，在碱性流动相条件下，能够充分保留和分离dNTP 4种化合物以及dCTP有关杂质，重现性佳，同时对于类似结构的极性化合物分离具有重大的参考意义。
液相色谱方法
仪器：Vanquish Core HPLC
色谱柱：Hypercarb，150 x 2.1 mm，3 μm（P/N 35003-152130）
流动相：A：己胺 (5mM) ，加入DEA (0.4%, v/v), 用冰醋酸调pH=10 B: 乙腈
流 速：0.3 mL/min
柱 温：30 ℃
进样量：5 μL
检测波长：UV 254/272 nm
具体梯度条件参见 AN_24053_CCS
dNTP 4种化合物分析
dNTPs是包含核苷和三磷酸基团的大极性化合物，如使用反相色谱柱，流动相添加离子对试剂是比较复杂的方法，同时不利于色谱柱寿命；在此之前，基于Hypercarb色谱柱耐受宽pH值（1-14）的特点， Hypercarb已成功应用于碱性条件下分析核苷酸和阿糖胞苷类化合物等含有单磷酸或者多磷酸基团的大极性化合物[1]，此方案同样考虑在碱性条件下保留和分离dNTPs。
参考阿糖胞苷测试方法，流动相A为己胺 (5mM) ，加入DEA (0.4%, v/v), 用冰醋酸调pH=10，流动相B为乙腈。图1展示了优化后梯度下的4种化合物单标定位谱图。
图1. 4种dNTP化合物单标定位谱图
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图2展示了dNTP 4种化合物重复性谱图，连续6针，4种化合物保留时间和峰面积RSD均小于1%。
图2. dNTP 4种化合物重复性谱图（n=6）
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在不同波长下分析dNTP 4种化合物，如图3所示，浓度均为50μM ，dCTP和dTTP在波长为272nm时响应更高，而dGTP和dATP在波长为254nm时响应更高，可根据实验的需求选择更合适的波长进行分析。
图3. 不同波长下dNTP 4种化合物响应谱图
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dCTP及相关杂质分析
当dCTP浓度为2.5 mM时,通过优化水相起始比例和梯度方法， dCTP和相关杂质均可以分离，峰型较好。对dCTP及相关杂质在Hypercarb色谱柱上保留和分离的重复性进行了研究，如图4所示，连续3针进样，重复性表现优异，保留时间和峰面积RSD＜1%。图5展示了不同波长下dCTP及相关杂质响应谱图，可以看到272nm下，二磷酸杂质和dCTP主峰响应更高。
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Hypercarb色谱柱使用及维护
Hypercarb色谱柱使用方法和反相色谱柱类似，但是由于其特殊的保留机理，流动相添加剂和污染物容易吸附在石墨化碳表面，需要及时对色谱柱进行清洗。本方案中，最高有机相比例为30%，需要定期使用高有机相冲洗色谱柱，一般建议80%乙腈冲洗20个柱体积以上。如果长时间使用后污染较为严重，可以反接色谱柱，使用纯乙腈低流速75℃柱温下冲洗120个柱体积以上[2]。
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为解决dNTPs 以及dCTP有关杂质这些大极性化合物的保留和分离问题，本文基于赛默飞 Vanquish Core HPLC液相色谱系统，应用Hypercarb色谱柱的特殊保留机理，开发了碱性流动相条件下的分离方案。该方案操作简单，分离效果佳，重现性优异，可为实验室保留分离同类型化合物提供参考方案，为分析人员带来极大便利。
参考文献：
[1] AN_21025_CCS_药物_Hypercarb色谱柱用于核苷酸类及其磷酸化衍生物的分析
[2] ThermoFisher Scientific Hypercarb色谱柱方法开发指南
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