B细胞成熟和抗体产生是成功预防和接种传染病疫苗的指标。淋巴组织内的 B 细胞激活区是 B 细胞遇到抗原并分化为抗体分泌细胞 (ASC) 的特殊生态位。生发中心 (GC) 反应在体细胞超突变 (SHM) 和亲和力成熟后建立持久的免疫力,将幼稚 B 细胞分化为浆细胞。严格调节的 GC 反应需要在 CXCL12 等的趋化因子作用下。然而,由于原代 GC B 细胞的快速丢失以及需要复杂的转录和表观遗传变化,因此离体复制 GC 具有挑战性。而基于 Matrigel 的扁桃体类器官主要集中在上皮感染中,基于 Transwell 的扁桃体细胞聚集体已证明对疫苗有响应 GC 形成。但是,目前的扁桃体模型没有捕捉到淋巴组织微环境对 GC B 细胞反应的影响,也没有捕捉趋化因子梯度对 B 细胞极化和成熟的影响。此外,目前的系统不能促进抗 CD20 治疗的淋巴瘤幸存者 B 细胞的 GC 反应。从淋巴瘤幸存者身上采集扁桃体、淋巴结或脾脏样本是不可行的,特别是如果有兴趣监测同一供体的缺陷随时间推移的恢复情况,因此需要来自更容易获得的来源的淋巴类器官,例如外周血单核细胞 (PBMC)。(Ankur Singh教授表示,他在学术界的工作蒸蒸日上,是因为自己学会了如何在精神和身体上保持平衡。——源自Nature 2024/03/12职场栏目的采访)美国佐治亚理工学院生物工程和生物科学研究所的Ankur Singh教授率领其团队开发了一种模拟淋巴组织微环境的合成水凝胶,使来自人类扁桃体和外周血单核细胞衍生 B 细胞的生发中心(CG)反应成为可能。来自外周血单核细胞的免疫类器官比扁桃体来源的免疫类器官维持 GC B 细胞和浆细胞的时间更长,并表现出独特的 B 细胞编程命运,包括 GC 区室、体细胞超突变、免疫球蛋白类别转换和 B 细胞克隆。转录和表观遗传过程的化学抑制促进了浆细胞的形成。虽然将极化 CXCL12 蛋白整合到淋巴器官芯片中可调节健康供体 B 细胞的 GC 反应,但淋巴瘤患者的 B 细胞则无法调节。该系统允许快速、可控地模拟免疫反应和B细胞失调。使用末端马来酰亚胺基团官能化的四臂聚乙二醇大分子单体(PEG-4MAL)设计了一种合成水凝胶,与半胱氨酸侧翼的VCAM-1模拟REDV肽结合。这些大分子单体与蛋白酶可降解交联剂肽(VPM)和非降解交联剂二硫苏糖醇(DTT)的混合物交联成水凝胶。具有固定VPM和DTT浓度的水凝胶的储能模量随着PEG-4MAL的重量百分比而增加。使用原子力显微镜量化了来自三个供体的新鲜分离扁桃体组织的硬度,在切片组织表面和内部的不同点上的杨氏模量为120至2800 Pa。7.5 wt%的PEG-4MAL水凝胶在天然扁桃体组织的刚度范围内实现了与具有固定粘附肽密度水凝胶相当的储能模量。在体内,抗原的存在激活CD4 T细胞分化为表达CD40L的滤泡性 T 辅助细胞(TFH),CD40L与B细胞上的CD40相互作用以启动GCs。将新鲜分离的扁桃体细胞的单核部分用可溶性CD40L或表达CD40L的成纤维细胞作为T细胞模拟物(CD40L-TCM)包裹在20µl 7.5 wt%PEG-4MAL(10 kDa)水凝胶中。流式细胞术显示,与没有CD40L相比,CD40L-TCM使扁桃体单核细胞的存活率增加了11.7±2.3倍,而可溶性CD40L使存活率提高了1.2±0.3倍。CD40L-TCM比可溶性CD40L更有效地增强细胞活力。掺入了人扁桃体衍生的FDCs(HK FDCs),导致活扁桃体单核细胞密度依赖性增加。CD40L和HK FDCs的存在是维持CD20 B细胞存活所必需的。变聚合物和交联剂的密度,并研究水凝胶力学性能对B细胞命运的影响。包括了PEG-4MAL/(粘附肽)/(总交联剂)的摩尔比4:1:1.5和4:1:3,以及不同的PEG-4MAL重量百分比。7.5
wt%的4:1:1.5水凝胶产生了明显更多的GC B细胞和抗体分泌细胞。人类扁桃体组织的成像显示,B细胞卵泡周围有I型胶原,增殖B细胞周围的卵泡中散布着I型胶原。用生物粘附肽对PEG-4MAL水凝胶进行了功能化:“REDV”、纤维连接蛋白模拟物“RGD”和胶原-I模拟肽“GFOGER”。与单独使用RGD或GFOGER相比,RGD和GFOGER共同导致GC B细胞和ASC在较硬的7.5 wt%10 kDa PEG-4MAL水凝胶中增加了两倍,而较软的7.5 wt%20 kDa PEG-4 MAL水凝胶则增加了一倍。在GFOGER+REDV+RGD组中,使用α4β1抑制剂抑制REDV与整合素α4βl的相互作用,使GC
B细胞恢复到GFOGER+RGD组的水平。扁桃体细胞培养的有限反应和寿命,以及对扁桃体切除术供体的需求,促使对基于PBMC的人类淋巴器官进行生物工程,以方便类器官的构建。在IL-4和IL-21存在的情况下,B细胞在基于PEG-4MAL的PBMC类器官中与GFOGER+RGD细胞外基质模拟肽、HK FDCs和CD40L-TCM形成3D聚集体,类似于扁桃体类器官。灭活的H1N1抗原通过水凝胶扩散,与PBMC类器官中的HK FDCs和B细胞共定位,模拟体内过程。当暴露于抗原时,基于PEG-4MAL的PBMC衍生类器官中的LiveCD19CD38hiCD27CD138
ASCs和LiveCD19loCD138浆细胞反应增加。PBMC衍生的类器官更好地代表B细胞分化。记忆B细胞(LiveCD19CD38CD27)在PBMC衍生的类器官中被诱导并持续24天。PBMC与扁桃体类器官的差异引发了扁桃体和PBMC中是否存在不同细胞类型的问题。虽然扁桃体衍生的类器官在第0天最初具有更高数量的TFH细胞,但这些数量在第4天趋于平衡。与扁桃体衍生类器官不同,PBMC衍生类器官在第4至12天显示TFH细胞增加了三倍。TFH细胞与类器官中的B细胞相互作用。流式细胞术证实PBMC中幼稚B细胞的比例较高,但扁桃体组织中CD19 B细胞、GC前B细胞和GC B细胞的总体比例更高。对来自扁桃体和PBMC样本的荧光激活细胞分选的CD19 B细胞进行大量RNA测序。CD19 B细胞的GSEA通路分析揭示了扁桃体来源的B细胞中炎症信号的上调。相反,PBMC衍生的CD19 B细胞显示出对其生存、代谢调节和细胞分裂控制所必需的途径的上调。扁桃体衍生类器官中非幼稚B细胞的存在对B细胞成熟动力学产生了负面影响。TLR7/8 刺激增强 B 细胞对 H1N1 疫苗的反应:与等效抗原剂量为106 CEID50的热灭活H1N1病毒相比,活H1N1(A/PR/8/34)病毒颗粒与PBMC衍生类器官中的B细胞共定位,并诱导总B细胞表型和GC
B细胞表型显著增加。用灭活A/PR/8/34 H1N1病毒抗原和5µM TLR7/8激动剂瑞喹莫特(R848)刺激的类器官在12天后显示出比对照组明显更多的LiveCD19 B细胞和LiveCD19CD27CD38 GC B细胞,与活病毒感染的培养物数量相似。对B细胞的TLR7/8刺激增强了GC B细胞对基于PEG-4MAL的PBMC类器官中灭活H1N1疫苗的反应。与扁桃体类器官和2D共培养相比,PBMC衍生的类器官表现出更多的抗原特异性反应。在第12天和第24天,H1N1+R848中的ELISpot 检测斑点明显高于单独H1N1或培养基组。4/5的PBMC供体的类器官在暴露于H1N1+R844后诱导出更高的流感特异型IgG分泌。使用生物素偶联的H1N1四聚体与链霉抗生物素蛋白/FITC或链霉抗免疫素蛋白/Vio Bright 667的组合进行流式细胞术分析表明,与单独的H1N1或单独的R848相比,H1N1+R848显著增强了抗原特异性GC B细胞和浆细胞群。PBMC样本可以同时具有针对H1N1的幼稚和记忆B细胞,记忆B细胞可以单独对R848刺激做出反应。去除记忆B细胞后,并像以前一样将幼稚B细胞与CD40L-TCM和FDCs以及BAFF、IL-4和IL-21细胞因子一起孵育。与单独使用H1N1或单独使用R848相比,暴露于H1N1+R848的类器官中GC B细胞和ASC的数量增加,并诱导了明显更高的IgG GC B细胞类转换。图:PBMC 衍生的基于水凝胶的类器官捕获供体变异性和佐剂反应为了实现生成 ASC 和浆细胞的目标,进行了 RNA 测序以识别不同类器官中 CD138 细胞的差异。在 H1N1 暴露的类器官中,GSEA 表明 PBMC 衍生的CD138 B 细胞中干扰素、炎症、Stat3/Stat5、PI3k-AKT-mTOR、胆汁酸和 TNF 信号上调,而 E2F 靶标和G2-M 检查点下调。H1N1 + R848 进一步下调 PBMC 中的糖酵解和 MYC 信号传导。时间维度上,在第 12 天,H1N1 + R848 下调干扰素、炎症、Stat3、PI3k-AKT-mTOR、胆汁酸和 TNF 信号传导。在第 24 天,氧化磷酸化和DNA 修复上调,而干扰素、炎症、Stat3/Stat5、PI3k-AKT-mTOR、E2F 靶标、G2-M 检查点和mTOR 信号传导以及通过 NF-κB 的 TNF 信号下调。在第4、 2、16和24天对从 H1N1 暴露或 H1N1
+ R848 暴露的 B 细胞进行了单细胞 RNA-seq。UMAP揭示了 6 个不同的 B 细胞簇,B细胞簇的多样性随着时间增加。第 2 簇,在第 4 天达到峰值,其主要包括早期 B 细胞活化基因 (CD40、BATF、CD69、CCR7 和 HMGB2)、增殖基因
(EZH2、AICDA 和AURKB) 和 GC B 细胞分化基因 (PAX5、SPIB、IRF8 和 CD83);第 3 簇由具有高增殖、活性 SHM 和以高 AICDA 、 PAX5 、 SPIB和 POU2F2 为特征的浆细胞分化的 GC B 细胞组成。随着 GC 成熟为浆细胞,增殖性ASC 会丢失 B 细胞标志物,在群集 0、1、4 和 5 中MHCⅡ类标志物被抑制。人 ASC 表达高水平的 CD27,在聚类 1 和 4 中较高。第 5 簇显著表达 MKI67,表明浆母细胞增生。ASC 成熟,以 CD19 下调为标志,CD19在簇 2 和 3 中突出,但在簇 4 和 5 中较低,在晚期簇 0 和 1 中不存在,表明浆细胞成熟。总的来说,这些发现表明,PBMC 类器官衍生的 ASC 和浆细胞表现出 XBP1、IRF4、PRDM1、CD27 和 CD19 的许多相似特征性表达。BCR测序以分析免疫球蛋白类别转换。比较 H1N1和 H1N1 + R848,显示第 0 簇和第 1 簇中向 IgG1
BCR 的类别转换占主导地位,其中 H1N1 + R848 显示更多的 IgG1。第 2 簇到第 5 簇,IgM 进行性降低,IgG1 表达增加,第 2 簇 IgM 表达较高。与单独使用H1N1 相比,H1N1 + R848 增加了第 0 簇和第 5 簇中的 IgG1 和 IgG2 水平。由浆细胞组成的簇 0 显示出 B细胞的最大克隆扩增。H1N1 + R848 在所有时间点和几乎所有簇中都表现出更多的克隆扩增。抗体在亲和力成熟过程中在其互补决定区
(CDR) 中积累突变。SHM 提供有关 ASC 成熟的重要信息。与簇 2 和 3 中活化的 B 细胞和 GC B 细胞相比,簇 0、1、4 和 5 中的 ASC 和浆细胞具有更多的重链 CDR 突变。与观察到的免疫球蛋白类别转换一致,第 6 组在 H1N1 + R848 条件下显示出更多样化的免疫球蛋白类别转换。在第 0、1、3 和 5 簇中,CDR 区域的突变在 24 天内逐渐增加,第 24 天最高。总体而言,类器官衍生的 ASC 和浆细胞显示出 SHM 值,这些 SHM 值随着时间的推移而增加,并在更成熟的细胞中积累。图:人类淋巴类器官的转录组学、BCR、克隆和 SHM 变化探索通过表观遗传和转录调控调节GC B细胞向浆细胞分化的表皮同源物增强子2(EZH2)和B细胞淋巴瘤6(BCL6)对ASC和浆细胞分化的影响。PBMC衍生的类器官上的单细胞RNA-seq表明EZH2在簇2和5中高水平表达。此外,BCL6在簇2中的表达很高。与单独使用H1N1相比,在PBMC衍生的类器官中CD19CD38CD27EZH2 GC B细胞和EZH2表达显著增加。在第12天,使用H1N1+R848治疗诱导了更多的H1N1特异性CD38CD27BCL6 GC B细胞。在第12天抑制了EZH2、BCL6或两者。与对照组相比,BCL6抑制剂或BCL6和EZH2抑制剂的组合在第16天和第24天诱导的GC B细胞明显减少。在第16天和第24天,添加这两种抑制剂诱导的CD19loCD138浆细胞是无抑制剂对照的两倍。在第24天,两种抑制剂处理组的抗原特异性分泌IgG较高,表明血清抗体分泌动力学相对于表型发育延迟。在第16天,两种抑制剂处理组的暗区GC B细胞显著减少,亮区GC B细胞增加,表明GC的暗区和亮区之间的典型交换被中断。抑制离体GC反应中的检查点靶点可以加速GC向浆细胞表型的分化。图:GC B 细胞中 EZH2 和 BCL6 的同时抑制促进了浆细胞的生成B细胞淋巴瘤幸存者的临床研究显示,与其他癌症幸存者相比,免疫相关疾病的发病率更高。为了了解接受化学免疫治疗的淋巴瘤患者感染风险增加和疫苗反应不佳背后的机制。使用来自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的PBMC,应用于PBMC类器官以预测对FDA批准的流感疫苗Fluzone的免疫反应。与单独使用Fluzone相比,Fluzone与R848联合使用可增强GC
B细胞、ASC、浆细胞和记忆B细胞的分化。从化学免疫治疗后缓解的患者(无复发指征)中获得了外周血单个核细胞。用Fluzone疫苗处理的PBMC类器官的流式细胞术分析显示,与淋巴瘤患者(n=8,治疗后12个月)相比,健康供体(n=8)的GC
B细胞和浆细胞明显更多。在体外,8例淋巴瘤病例中有6例产生的GC B细胞比健康对照组少,所有DLBCL样本的浆细胞反应均显著降低。这反映了淋巴瘤患者对疫苗的整体免疫反应受损的临床发现,其中一些人的反应与健康人相似,而另一些人则没有反应。与健康供体类器官相比,Fluzone+R848在DLBCL患者类器官中诱导了明显较弱的GC反应。DLBCL类器官中R848缺乏额外反应表明佐剂反应受损。在六种血清型的DLBCL类器官中,IgG血清抗体水平显著降低。这些发现强调了PBMC衍生的类器官在反映不同免疫功能和功能障碍方面的有效性,揭示了B细胞失调和疫苗反应不良的机制,并为相应群体确定了治疗靶点。图:抗 CD20 免疫疗法损害淋巴瘤患者重组 B 细胞的 GC 形成能力在体内,基质细胞通过分泌趋化因子如CXCL12,调节GC中亮区和暗区的空间分布。假设基于微流体的CXCL12梯度可以提供淋巴类器官中亮区和暗区结构的受控分离,开发了一种具有淋巴细胞包封的水凝胶和梯度分布CXCL12的基于PEG-4MAL水凝胶的B细胞类器官芯片。PEG-4MAL水凝胶中的FITC-BSA分布显示出极化分布,集中在面向高流量的边缘a,仅用盐水的边缘b则减少。在没有CXCL12的情况下,扁桃体类器官中的暗区和亮区GC B细胞随机分布。当CXCL12在X方向上发生空间极化时,CXCR4 B细胞向左迁移,而CXCL12的Z方向极化则将它们吸引到顶部。定量分析显示,在三个PBMC供体和两个设备复制品上具有趋化因子梯度的设备中,CXCR4细胞向左半圆的一致极化。相比之下,没有趋化因子梯度或没有趋化蛋白的设备在复制品和供体之间显示出不一致的极化。与没有趋化因子梯度的装置和没有趋化蛋白的装置相比,CXCL12趋化因子的极化分布增加了上清液中IgG1抗体的产生。无论梯度如何,细胞因子的产生都受到CXCL12存在的影响。CXCL12极化分布显著增加了IL-6、IL-12p70、TNF-α、IFNγ、IL-2、IL-10、IL-17、APRIL和TNF-b的产生。这些结果为CXCL12趋化因子的极化分布在活化B细胞分泌细胞因子中可能发挥的调节作用提供了新的见解。有趣的是,观察到CD4 T细胞在CXCL12高区域中富集,表明芯片上的淋巴器官模拟了体内GC生物学。研究DLBCL患者来源的PBMCs中GC B细胞形成受损是否是由于创建分区结构的局限性。当暴露于Fluzone+R848时,与健康供体不同在PEG-4MAL类器官中的DLBCL患者来源的外周血单核细胞没有形成类似亮区和暗区的簇。在具有极化CXCL12趋化因子的淋巴器官芯片模型中,DLBCL衍生的B细胞也未能像其健康对应物那样进行区隔。定量分析显示,健康供体的CXCR4细胞向高CXCL12区域持续极化,但淋巴瘤供体没有。这表明化疗后的B细胞可能会失去形成必要区隔的能力,从而可能损害体液免疫。开发离体免疫反应模型具有挑战性,因为它必须模拟 B 细胞成熟并预测疫苗反应。作者团队开发的 PBMC 衍生的类器官支持细胞亚群的存活,并提供了一个合适的平台来研究淋巴瘤患者随时间变化的 GC 反应。这种方法可以通过识别有疫苗反应不良风险的患者并相应地调整干预措施,从而显着改善 B 细胞耗竭治疗后的临床管理。这项工作强调了使用初始 B 细胞和 CD40L 细胞来开发稳定 GC 表型的潜力,即使在没有 TFH 细胞的情况下也是如此。未来的工程系统可以力求可控的亲和力成熟,通过鉴定免疫原性表位和佐剂或产生单克隆抗体来增强疫苗设计。此外,芯片上的淋巴器官可以与多器官系统集成,以模拟整个人体的复杂免疫相互作用,为更全面和更具预测性的人类免疫反应研究铺平道路。Zhe Zhong, Manuel Quiñones-Pérez, Zhonghao Dai, et al. Human immune
organoids to decode B cell response in healthy donors and patients with
lymphoma. Nat Mater. 2024 Nov 6.https://www.nature.com/articles/s41563-024-02037-1
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