科研动态｜彭琴课题组开发mRNA修饰m⁶A的活细胞可视化探针并揭示其与应激颗粒的内在联系

N6-甲基腺苷修饰（m⁶A）是迄今为止已知的最丰富的RNA内部化学修饰，广泛参与RNA转录、剪接、转运、翻译及降解等多个重要生物学过程【1】。m⁶A修饰的异常调控与多种疾病的发生密切相关，已成为潜在的临床治疗靶点。在细胞应对热休克、高渗透压以及NaAsO2处理等应激条件下，翻译受阻的mRNA与多种RNA结合蛋白通过液-液相分离（LLPS）在细胞质中聚集，形成应激颗粒（SG）【2】。近年来的研究揭示，m⁶A修饰的mRNA及其结合蛋白YTHDFs在应激颗粒中富集，并且体外研究证实YTHDFs与多价m⁶A修饰的RNA相互作用，促进LLPS过程【3】。然而，m⁶A修饰是否促进mRNA在应激颗粒中的富集，以及其结合蛋白在SG解聚过程中的具体作用，仍不清楚。

2024年11月15日，深圳湾实验室彭琴课题组在Science Advances在线发表了题为Decoding the Interplay between m⁶A Modification and Stress Granule Stability by Live Cell Imaging 的研究论文。该研究团队基于荧光共振能量转移（FRET）技术，设计并开发了一款用于特异性检测mRNA m⁶A修饰的传感器（spatiotemporal m⁶A imaging system, SMIS），实现了m⁶A修饰的mRNA在活细胞中的动态可视化。借助SMIS系统，作者观察到了m⁶A修饰的mRNA在应激颗粒中的富集过程，并揭示了其在应激颗粒解聚时逐步释放至胞质的动态机制。此外，团队发现，敲低YTHDF2蛋白会加速应激颗粒的解聚，进而导致富集于颗粒中的m⁶A修饰的mRNA迅速释放并恢复翻译。

图1 SMIS系统特异性识别报告mRNA的m⁶A修饰

针对RNA m⁶A修饰的FRET传感器的设计与传统基于蛋白质的FRET探针有所不同，其底物为RNA，因此其难以与识别蛋白融合表达。为了解决这一技术难题，作者首先设计了一个用于检测m⁶A修饰mRNA的报告基因。该基因包含多西环素响应的诱导表达元件、miniCMV启动子、带有双核定位序列（NLS）的mMaroon1荧光蛋白，以及22个偶联MS2适配体的m⁶A共识基序（GGACU）。

接下来，作者设计了特异性识别该mRNA m⁶A修饰的FRET探针。该探针由识别m⁶A修饰的YTH结构域、黄色荧光蛋白YPet、柔性连接臂、青色荧光蛋白ECFP，以及识别MS2的MCP蛋白组成。m⁶A修饰mRNA的报告基因与FRET探针共同构成了具有时空分辨率的m⁶A活细胞成像系统，即SMIS系统（见图1A）。

在报告mRNA未发生m⁶A修饰时，只有MCP蛋白与报告mRNA的3' UTR区域中的MS2结合，此时FRET受体YPet荧光蛋白与FRET供体ECFP荧光蛋白之间的距离较远，FRET效率较低。当报告mRNA发生m⁶A修饰时，YTH结构域与m⁶A修饰位点结合，导致YPet荧光蛋白靠近ECFP荧光蛋白，从而显著增强FRET效率。通过突变失活YTH结构域以及m⁶A共识基序，作者进一步验证了该SMIS系统在报告mRNA m⁶A修饰示踪中的特异性和灵敏性（见图1B-C）。

图2 SMIS系统监测METTL3介导的m⁶A修饰改变

为了进一步验证SMIS系统对m⁶A修饰的动态响应，作者首先在稳定转染SMIS系统的HeLa细胞（SMIS-WT）中采用siRNA敲低m⁶A修饰的甲基转移酶METTL3，然后添加多西环素以诱导报告mRNA的生成。结果显示，与随机siRNA相比，METTL3的siRNA显著降低了FRET效率。此外，作者对SMIS-WT细胞处理METTL3抑制剂STM2457，并利用合作者W.S. Sho Goh研究员开发的m6ACE测序技术对报告mRNA上的m⁶A修饰水平进行半定量分析。结果表明，STM2457处理可显著抑制报告mRNA的m⁶A修饰（见图2A-B）。进一步分析显示，STM2457处理也显著降低了SMIS-WT细胞的FRET信号，表明SMIS系统对m⁶A修饰的变化具有较高的灵敏性（见图2C-D）。为了评估SMIS系统对m⁶A修饰的动态检测能力，作者在多西环素诱导报告mRNA生成后12小时观察到FRET信号进入平台期。

此时，加入STM2457抑制剂并继续诱导mRNA的生成。随着低m⁶A修饰报告mRNA的产生，FRET效率逐渐下降，表明SMIS系统能够在活细胞内动态监测m⁶A修饰水平的变化（见图2E）。

图3 SMIS系统揭示m6A修饰报告mRNA在SG的动态富集

m⁶A修饰是否促进mRNA在应激颗粒（SG）中的富集一直存在争议。针对这一问题，作者利用SMIS系统动态观测了报告mRNA在SG形成和解散过程中的时空信息以及m⁶A修饰水平。结果显示，报告mRNA与SG显著共定位，并且随着SG的形成与成熟，SG中的FRET信号逐渐上升，这表明SG中的报告mRNA具有更高的m⁶A修饰水平（见图3A-B）。此外，作者共表达了报告mRNA与MCP-3×GFP，后者能够清晰标记报告mRNA。结果显示，MCP-3×GFP与SG的标志蛋白G3BP1显著共定位。在敲低METTL3后，SG中富集的EGFP水平显著降低，进一步支持了m⁶A修饰促进mRNA在SG中富集的观点（见图3D-F）。

为了研究m⁶A修饰结合蛋白在应激颗粒（SG）解聚过程中的作用，作者首先敲低了三种m⁶A修饰的胞质结合蛋白：YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。结果显示，YTHDF2显著促进了SG的解聚。接下来，作者利用SMIS系统动态观察了YTHDF2敲低后报告mRNA与SG的关系，发现YTHDF2的减少不仅促进了SG的解聚，还加速了SG中FRET信号的下降，表明m⁶A修饰mRNA的减少。在SG形成过程中，总体mRNA的翻译速率被抑制，而随着SG的解聚，mRNA的翻译逐渐恢复。通过SMIS系统，作者进一步探讨了YTHDF2对SG解散过程中mRNA翻译的影响。结果显示，YTHDF2的敲低促进了报告mRNA的翻译。综上所述，敲低YTHDF2明显加速了SG的解聚，从而释放m⁶A修饰的mRNA，并促进其快速翻译。

为了进一步揭示YTHDF2调控应激颗粒（SG）功能和稳定性的机制，作者首先定量分析了YTHDF2敲低后G3BP1的水平。结果表明，G3BP1水平微弱上升，这说明YTHDF2并不是通过直接降低G3BP1的水平来调节SG的稳定性。接着，作者通过共免疫沉淀（CO-IP）实验验证了YTHDF2与G3BP1之间的相互作用，发现这种相互作用依赖于RNA及其m⁶A修饰。进一步的光漂白荧光恢复实验（FRAP）显示，敲低YTHDF2导致G3BP1-EGFP的流动性增强。结合以上实验结果，可以得出结论：YTHDF2与G3BP1的相互作用增强了SG的稳定性，并富集了m⁶A修饰的mRNA。同时，m⁶A修饰的mRNA也反过来增强了YTHDF2与G3BP1之间的相互作用。这种依赖于m⁶A修饰的多重RNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用共同维持了SG的稳定性及其对m⁶A修饰mRNA的偏好性。

综上所述，该研究首次开发了具有高特异性和灵敏度的RNA m⁶A修饰活细胞成像系统SMIS，揭示了m⁶A修饰在应激颗粒形成与解散过程中的动态行为及其调控机制。该研究为理解m⁶A修饰在细胞应激响应中的功能提供了新的视角，或为相关疾病的诊断和治疗提供潜在策略。

深圳湾实验室系统与物理生物学研究所彭琴研究员为本文的通讯作者。深圳湾实验室系统与物理生物学研究所副研究员李倩倩为第一作者。感谢南加州大学王英晓教授、深圳湾实验室分子生理学研究所W.S. Sho Goh研究员、深圳湾实验室神经疾病研究所张轲研究员、重庆大学生物工程学院邱菊辉研究员、深圳湾实验室分子生理学研究所邓麟研究员、研究助理刘健等为本研究做出了重要贡献。

参考文献

1. S. Deng, J. L. Zhang, J. C. Su, Z. X. Zuo, L. X. Zeng, K. J. Liu, Y. F. Zheng, X. D. Huang, R. H. Bai, L. S. Zhuang, Y. Ye, M. Li, L. Pan, J. G. Deng, G. D. Wu, R. Li, S. P. Zhang, C. Wu, D. X. Lin, J. J. Chen, J. Zheng, RNA m⁶A regulates transcription via DNA demethylation and chromatin accessibility. Nat. Genet. 54, 1427-1437 (2022).

2. R. J. Ries, S. Zaccara, P. Klein, A. Olarerin-George, S. Namkoong, B. F. Pickering, D. P. Patil, H. Kwak, J. H. Lee, S. R. Jaffrey, m⁶A enhances the phase separation potential of mRNA. Nature 571, 424-428 (2019).

3. Y. Fu, X. W. Zhuang, m⁶A binding YTHDF proteins promote stress granule formation. Nat. Chem. Biol. 16, 955-963 (2020).