【文献读图】细胞凋亡流式图怎么看?1分钟速解(附28种数据图解读PDF)

文摘   2024-12-19 18:30   浙江  

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导读
1.基础概念
2.细胞凋亡流式图怎么看?
3.流式细胞术中的“设门”是什么?
4.如何正确设门?


01
基础概念
检测细胞凋亡时,样本中除了有活细胞外,还会存在以下3种状态的细胞:

1)早期凋亡(早凋)
  • 细胞膜结构变化:细胞膜结构发生改变,磷脂酰丝氨酸外翻,但细胞膜仍然保持完整。

  • 检测方法:常用Annexin V/PI双染色法。Annexin V能与外翻的磷脂酰丝氨酸高亲和力结合,而PI无法透过完整的细胞膜(PI是一种核酸染料,在细胞膜完整的情况下,无法进入细胞染核),因此早期凋亡细胞仅被Annexin V染色,而PI阴性。


2)晚期凋亡(晚凋)
  • DNA降解:DNA被降解为约180~200bp的片段,这是晚凋的一个显著标志。

  • 细胞膜破裂:细胞膜破裂,导致细胞内容物的释放。

  • 检测方法:Annexin V/PI双染色法检测时,PI能透过破裂的细胞膜与DNA结合,因此晚凋细胞同时被Annexin V和PI染色。


3)坏死
  • 细胞膜破裂:坏死细胞的细胞膜破裂早于DNA降解,导致细胞内容物外溢,引起局部炎症反应。

  • 检测方法:与晚凋细胞一样,在坏死细胞中,PI能透过坏死的细胞膜与DNA结合,因此坏死细胞能同时被Annexin V和PI染色。但PI染色会更为强烈一些,因为细胞膜破裂严重。

02
细胞凋亡流式图怎么看?

案例1


元素解读
纵坐标代表该细胞样本在这个通道上的荧光强度;PI是一种核酸染料,用于检测细胞凋亡,细胞膜完整的情况下无法进行细胞染核
横坐标代表该细胞样本在这个通道上的荧光强度;Annexin V是用于检测细胞凋亡的试剂(原理详见基础概念),Annexin V可带上荧光素(如FITC、APC等)
一个点代表一个细胞
(PI-/Annexin V-)双阴性,为活细胞,占比是90.6%
(PI+/Annexin V-),为机械损伤等其他细胞,占比是0.06%

(PI-/Annexin V+),为早凋细胞,占比是9.20%

(PI+/Annexin V+),为晚凋细胞和坏死细胞,占比是0.16%


//////


案例2



元素解读
变量:是否进行UVB照射
对照组
③一种药物

结果解读
Annexin V-FITC/PI双染显示,UVB(+)组中凋亡细胞的比例显著增加(占比23.2%),但在silibinin治疗后细胞凋亡的比例降低(占比7.4%)。

03
流式细胞术中的“设门”是什么?

设门就是在流式细胞仪生成的散点图或直方图上,通过手动或自动的方式划定一个或多个区域(即“门”),这些区域代表了具有特定特征的细胞群体(通俗点说,设门就是选中目标研究细胞群)。


设门的形状可以是任意的,如线性门、矩形门、圆形门、椭圆形门、多边形门和四象限门(十字门)等,具体形状取决于细胞类群分布的特点和研究目的。



04
如何正确设门?

1)明确分析目的
在设门之前,首先要明确分析的目的,即需要区分哪些细胞群体。这有助于在复杂的细胞分布图中快速找到目标细胞。

2)选择合适的参数
流式细胞术可以检测多种参数,如前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)、荧光强度等。根据分析目的选择合适的参数进行设门。例如,FSC和SSC常用于区分细胞大小和颗粒度,荧光强度则用于检测细胞内的特定分子。

3)设定阈值
使用FSC或SSC等物理信号设定阈值,以排除细胞碎片、气泡和激光背景噪声等干扰因素。阈值设定应尽可能客观,以减少主观判断带来的误差。

4)联合设门
利用多个参数联合设门可以更加准确地区分细胞群体。例如,可以使用FSC和SSC联合设门来区分不同大小的细胞群体,再结合荧光信号进一步区分表达特定分子的细胞。

5)应用荧光阴性对照
在设门过程中,应用合适的荧光阴性对照有助于区分阳性信号和阴性的荧光背景。这可以提高设门的准确性和可靠性。

6)排除死细胞
通过检测细胞活性的标记(如PI或7-AAD)来区分活细胞与死细胞。在设门时,应确保将死细胞排除在分析区域之外。

7)使用共享标记物
如果合适,可以使用一种在所有目标细胞中都表达的共享标记物(如CD45白细胞标记)进行染色。这有助于在分析稀少细胞类型时提高设门的准确性。

8)验证设门结果
设门完成后,应使用显微镜观察或其他验证手段来确认设门的客观性和准确性。这有助于减少主观判断带来的误差。

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