糖尿病是一种以持续高血糖为特征的代谢性疾病，其原因可能是胰腺β细胞被破坏导致胰岛素产生不足，或者是机体组织对分泌胰岛素的反应性降低（或胰岛素敏感性降低），或者两者兼而有之。那么关于糖尿病有什么课题设计思路呢？我们结合案例一起来探讨一下吧~
下面，我们将分享一篇发表于中科院1区期刊Cell Reports Medicine，影响因子为11.7的高分文献，名为《骨转运诱导具有多组织再生潜能因子的释放，促进糖尿病大鼠和患者伤口愈合》，希望能给大家带来不一样的灵感~
【文章题目】：骨转运诱导具有多组织再生潜能因子的释放，促进糖尿病大鼠和患者伤口愈合
【发表期刊】：Cell Reports Medicine
【影响因子】：IF=11.7
【发表日期】：2024.06
【原文获取】：公众号内发送关键词“20241129”即可获取原文文献
①Ilizarov骨运输（BT）手术最初是为了治疗一些复杂的骨科疾病而开发的。
②改良的Ilizarov胫骨皮质横向牵引（TCTD）是一种基于张力-应力效应治疗糖尿病足溃疡（DFUs）的新方法。然而，手术的风险和费用阻止了大多数DFU患者使用TCTD。
③多种细胞因子和激素，如血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白、免疫因子和基质细胞衍生因子，在BT和牵张成骨过程中增加。
④目前没有证据表明这些因素与BT刺激的再生之间存在因果关系，并且在BT期间再生潜力如何被激活尚不清楚。
1.sEV的释放对于糖尿病患者和大鼠的BT加速伤口愈合至关重要
为了证实BT对DFU愈合的影响，研究者随访了12例接受TCTD治疗的DFU患者。图1A显示了TCTD在典型难治性DFU病例中的治疗效果，表明BT促进了组织再生。然后，如图1B所示，建立BT12大鼠模型，分为假手术组和BT组，发现BT对糖尿病大鼠创伤恢复有明显促进作用。
图1A~H
接着，在细胞实验中，将BT治疗前后获得的患者血浆加入到原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人真皮成纤维细胞（HDF）中。我们可以从图1C~D发现，BT后患者的血浆显著促进HUVEC血管生成和HDF迁移。在图1E~F中，纯化的小细胞外囊泡（sEV）通过透射电镜、粒径分析和WB进行验证。图1G~M显示，BT大鼠血浆sEV浓度远高于Sham组，但经sEV分泌抑制剂GW4869处理后，BT大鼠血浆中sEV的分离量明显减少，伤口愈合速度明显降低，创面皮肤厚度、胶原沉积、新生血管水平、成纤维细胞数量、神经束数量均显著降低。并且我们可以从图1N看到，成骨细胞有助于BT期间血浆sEV的增加。上述证据表明sEV的分泌对于糖尿病患者和大鼠的BT加速伤口愈合至关重要。
图1I~N
2.在BT过程中释放的sEV对糖尿病伤口愈合具有多组织再生活性
为了评估BT过程中sEV的再生功能，作者在糖尿病鼠下肢缺血模型中测试了sEV对糖尿病终末循环重塑的影响。然后采用RFLSI III型激光散斑成像系统分析缺血下肢血流灌注率和血流速度，如图2A所示，BT-sEV治疗后血流速度和灌注率显著升高。这提示BT-sEV可促进糖尿病终末期循环的重建。周围神经病变是DFU的常见病因之一。我们还可以从图2B观察到，BT-sEV显著加速了db/db小鼠背根节（DRG）神经元的生长。这表明BT-sEV在改善糖尿病周围神经病变方面具有很强的潜力。而图2C~G则显示，含有BT-sEV的水凝胶能有效促进糖尿病小鼠的伤口愈合，增加再生皮肤的厚度、胶原沉积率、新生血管、成纤维细胞和神经束水平。另外，我们可以从图2J~I结果发现，BT-sEV更容易在创面中积累，而不是在内脏中；且更容易被HUVEC和HDFs结合。这些结果表明BT-sEV倾向于在糖尿病伤口中积累。
图2A~K
3.抗氧化剂和促再生miRNA在BT期间在血浆和sEV中富集
接着，作者对sEV进行KEGG分析，图3A显示BT-sEV中谷胱甘肽代谢、叶酸生物合成和核黄素代谢被激活。图3B显示，一些抗氧化蛋白在BT-sEV中上调，即谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）和过氧化氢酶（CAT）。这些抗氧化剂可能减少高糖诱导的氧化微环境，促进糖尿病创面的再生。图3C~E的miRNA测序分析显示，在TCTD后的4例患者中，只有4个miRNA上调，分别是miR-146b-3p、miR-576-5p、miR411-5p和miR-494-3p。其中，miR-494-3p的活性最强，如图3F~H所示，其抑制剂阻止HUVECs和HDFs进行血管生成和迁移，BT-sEV中miR-494-3p水平也远高于Sham组。并且从图3I可以看到，ago-miR-494-3p能有效促进糖尿病小鼠创面愈合。图3I~J显示，它不仅能激活成纤维细胞，还能促进伤口微血管再生；相反，miR-494-3p抑制剂阻断了愈合过程。
图3A~J
4.miR-494-3p靶向CRMP4并促进BT刺激糖尿病伤口愈合
为了进一步研究miR-494-3p在BT刺激的糖尿病伤口愈合中的功能作用，如图4A所示，作者构建了miR-494敲除（miR-494-/-）大鼠。图4B~F显示，BT对糖尿病大鼠的促进作用在miR-494-/-明显减弱。这些结果支持了miR-494-3p在BT促进的糖尿病创面修复中发挥重要作用的假设。图4G~H的双荧光素酶实验则确定了miR-494-3p的靶基因折叠反应中介蛋白4（CRMP4）。接着，我们可以从图4I结果观察到，BT组创面部位的CRMP4水平下降，而BT-miR-494-/-组的CRMP4水平没有变化，这表明CRMP4可能参与了BT刺激的创面愈合。图4J显示，抑制miR-494-3p则显著增加了CRMP4蛋白的水平。图4K~L显示，CRMP4敲低则逆转miR-494-3p过表达。这些结果表明，BT-sEV中的miR-494-3p通过直接靶向CRMP4 30 UTR下调CRMP4的表达，从而促进BT刺激糖尿病伤口愈合。
图4A~L
5.Rg1或agomir-494-3p与谷胱甘肽联合使用可有效加速糖尿病小鼠伤口愈合
然后，考虑到高糖诱导的氧化微环境可能会阻碍创面修复以及BT可提高抗氧化水平，作者将agomir-494-3p和GSH混合到壳聚糖水凝胶（agomir+GSH）中，应用于糖尿病小鼠背部创面。从图5A~E发现联合用药方案的疗效明显优于单独使用agomir-494-3p。使用8-OHdG作为生物标志物来评估体内氧化损伤和修复。图5F的免疫组化显示，混合方案产生更少的8-OHdG表达。这些发现提示miR-494-3p与抗氧化剂的结合可能改善局部氧化还原环境，促进高血糖状态下的伤口修复，并动员多组织再生。
图5A~F
由于现阶段miRNAs还不适合临床使用，作者下一步尝试筛选能够提高miR494-3p表达的药物用于治疗DFU。筛选天然产物药库得到三种能够促进内源性miR-4943p表达的药物，分别是人参皂苷Rg1、水飞蓟宾素和桧木醇。如图6A~D所示，人参皂苷Rg1可以显著增加内源性miR-494-3p在HUVECs和HDFs中的表达，促进HUVEC血管生成和HDF迁移的强活性。此外，我们可以从图6E看到，口服Rg1 24h后，糖尿病小鼠血浆中miR-494-3p水平显著升高，表明Rg1可以提高体内miR-494-3p水平。更引人注目的是，与agomir+GSH类似，如图6F所示，Rg1+GSH也加速了糖尿病小鼠的伤口愈合。同时，我们可以从图6G~K看到，Rg1+GSH组再生皮肤的厚度、胶原积累率、新生血管、成纤维细胞和神经束数量、抗氧化水平均显著提高。这些结果表明Rg1或agomir-494-3p与抗氧化剂GSH联合使用可有效加速糖尿病小鼠的伤口修复。
图6A~K
6.口服Rg1和GSH方案加速难治性DFU患者的伤口愈合
为了验证Rg1+GSH治疗难治性DFU患者的有效性，作者又进行了一项随机、单中心、安慰剂对照、双盲试验（ChiCTR 2200055194）。33名患者口服Rg1+GSH，33名患者接受安慰剂治疗，直到伤口愈合或12周试验结束。图7A提供了每组的详细数据，总的来说，口服Rg1和GSH是安全的，耐受性良好，且有显著疗效。此外，我们可以从图7B~C看到，在干预前和干预后4周，Rg1+GSH组血浆中miR-494-3p水平显著升高，ROS水平显著降低，而安慰剂组变化不大。同时采集创面组织标本，进行组织学评价。图7D显示，安慰剂组仍有许多坏死细胞，但Rg1+GSH组组织中没有坏死细胞。图7E显示，Rg1+GSH干预4周后，8-OHdG和CRMP4降低。图7F的CD31和a-SMA染色证实，Rg1+GSH处理也增强了血管生成。这些结果证实，口服Rg1和GSH方案可以显著加速难治性DFUs患者的伤口愈合，并且具有很高的安全性。
图7A~F
本研究表明，人和大鼠在BT过程中会释放抗氧化蛋白和具有多组织再生潜能的sEVs。这些囊泡聚集在糖尿病伤口中，并富含miRNA（如miR-494-3p），它们具有很高的再生活性，能改善缺血下肢的血液循环，同时还能促进血管新生、成纤维细胞迁移和神经纤维再生。大鼠缺失miR-494-3p会降低BT对糖尿病伤口的有益作用，而含有miR-494-3p和GSH的水凝胶则能有效修复伤口。重要的是，人参皂苷Rg1能上调miR-494-3p，一项随机对照试验证实，口服Rg1和GSH能加速难治性DFU患者的伤口愈合。这些发现确定了组织再生的潜在功能因子，并提出了一种治疗DFU的潜在疗法。
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