下面，我们将分享一篇发表于中科院1区期刊Journal of Hazardous Materials，影响因子为12.2的高分文献，名为《ALKBH5 SUMO化介导的FBXW7 m6A修饰在1-硝基芘诱导的肺纤维化过程中调控肺泡细胞衰老》，希望能给大家带来不一样的灵感~
【文章题目】：ALKBH5 SUMO化介导的FBXW7 m6A修饰在1-硝基芘诱导的肺纤维化过程中调控肺泡细胞衰老
【发表期刊】：Journal of Hazardous Materials
【影响因子】：12.2
【发表日期】：2024.04
【原文获取】：公众号内发送关键词“20250111”即可获取原文文献
①团队之前的一份报告表明，1-硝基芘（1-NP）暴露会引起肺上皮细胞的肺纤维化。
②II型肺泡上皮细胞（AEC2）的衰老是肺纤维化发生的重要驱动因素。
③肺间质纤维化患者的肺部存在端粒缩短和细胞衰老。然而，慢性1-NP暴露在肺纤维化过程中是否会导致端粒损伤和细胞衰老还有待探讨。
④RNA m6A修饰参与了肺纤维化的发生和发展，并且RNA m6A修饰的动态平衡对于维持细胞衰老具有重要意义。
⑤RNA m6A修饰是否与1-NP诱导的细胞衰老和肺纤维化有关，目前尚不清楚。
1.慢性1-NP暴露诱导小鼠肺和肺泡上皮细胞衰老
慢性1-NP治疗对肺泡上皮细胞纤维化作用的影响已得到证实，因此作者开始了进一步的实验研究。图1A~B与衰老相关的β-半乳糖苷酶测定法（SA-β-gal）染色显示，1-NP组小鼠肺中SA-β-gal阳性细胞数量增加。图1C~E则显示，1-NP处理小鼠的细胞衰老内乳蛋白B1（Lamin B1）减少，衰老相关异染色质灶γ-H2AX升高。此外，作者还评估了慢性1-NP暴露对小鼠肺上皮（MLE）-12细胞和人AEC2细胞衰老的影响。我们可以从图1F~K结果发现，1-NP暴露增加了SA-β-gal阳性细胞的数量，还引起MLE-12细胞中γ-H2AX阳性细胞核表达上调，MLE-12细胞和人AEC2细胞中Lamin B1表达下调。作者还检测了MLE-12细胞中衰老相关分泌表型（SASP）的表达。结果表明，1-NP处理后，MMP2和MMP13蛋白水平升高，如图1L~Q所示，而TIMP1和TIMP2蛋白水平降低。
图1A~Q
2.慢性1-NP暴露诱导小鼠肺和肺泡上皮细胞端粒损伤
接下来，作者观察了慢性1-NP对小鼠肺组织端粒损伤的影响，如图2A~D所示，慢性1-NP暴露明显降低了保护蛋白组分的蛋白表达水平，如端粒重复结合因子2（TRF2）、端粒保护蛋白1（TPP1）和TERF1相互作用核因子2（TIN2）。图2E~G的免疫荧光表明，1-NP暴露显著降低了小鼠肺中上皮细胞钙粘蛋白（E-cad）和TRF2的共定位，还降低了小鼠肺组织中的端粒长度。此外，还探讨了1-NP处理对MLE-12细胞和人AEC2细胞端粒损伤的影响。如图1H~K结果显示，1-NP处理后，TRF2、TPP1和TIN2蛋白水平下降。我们还可以通过图2L~O的qPCR和Q-FISH实验发现，1-NP处理后MLE-12细胞的端粒长度减少。在染色体末端，1-NP处理后MLE-12细胞的端粒丢失增加。
图2A~P
3.1-NP促进肺泡上皮细胞中FBXW7降解TRF2泛素和蛋白酶体
接着，作者开始研究TRF2是否通过泛素-蛋白酶体途径降解，图3A~D的Co-IP实验显示，1-NP暴露后，MLE-12细胞中TRF2抗体沉淀的泛素与TRF2之间的免疫复合物水平升高，促进了TRF2与泛素沉淀之间的相互作用。图3E显示，UbiBrowser网站预测TRF2可能与E3泛素连接酶FBXW7结合。图3F~I显示，1-NP处理后MLE-12细胞中FBXW7表达升高，FBXW7泛素化底物c-MYC和cyclin E1减少。
图3A~Z
然后，我们可以从图3J~K的CHX chase实验结果发现，1-NP暴露促进了MLE-12细胞中TRF2的降解，而FBXW7 siRNA显著缓解了TRF2的降解。图3L~N显示，MG132处理进一步提高了FBXW7 siRNA介导的TRF2的增加。图3O~P的Co-IP则证明了TRF2和FBXW7的互作。同时，图3Q~S的Co-IP实验还发现，FBXW7 siRNA减轻了1-NP诱导的TRF2泛素和蛋白酶体降解。图3T~U的定位分析显示，在MLE-12细胞的细胞核中，TRF2与FBXW7存在显著的共定位。我们从图3V~Z还发现FBXW7 shRNA明显减轻了1-NP诱导的端粒长度缩短和TRF2下降，以及细胞衰老。
4.1-NP通过ALKBH5-YTHDF1依赖的方式在肺泡上皮细胞中升高FBXW7 m6A修饰
为了评估在1-NP处理的肺泡上皮细胞中FBXW7升高的潜在原因，作者检测了FBXW7 mRNA的水平。图4A~C显示，1-NP暴露后，MLE-12细胞和人AEC2细胞中FBXW7蛋白表达升高，然而，对肺泡上皮细胞中FBXW7 mRNA没有影响。通过图4D~F的Ribo-seq和mRNA-seq发现，1-NP显著上调MLE-12细胞中FBXW7 mRNA的翻译效率，增加蛋白表达。图4G~H的Dot-blotting实验结果显示，急性1-NP暴露后，MLE-12细胞的mRNA m6A修饰整体增加；此外，图4I~K显示急性1-NP治疗并不影响m6A修饰的两种甲基化酶METTL3和METTL14的表达。然而我们从图4I~M发现，ALKBH5，m6A修饰的去甲基化酶从6小时开始下降，并在1-NP处理后24小时持续下降。
图4A~X
我们从图4N中可以发现，SRAMP网站预测FBXW7 mRNA存在丰富的m6A修饰位点。图4O显示，使用GEO数据库获得FBXW7的单核苷酸m6A位点。图4P的MeRIP-RT-qPCR进一步证实，急性1-NP暴露会升高MLE-12细胞中FBXW7 mRNA的m6A修饰。图4Q~S显示，ALKBH5过表达在MLE-12细胞中显著恢复了1-NP引起的FBXW7升高。图4T~W显示，m6A阅读蛋白YTHDF1从6小时开始上调，并在1-NP处理后24小时持续升高。图4X的RIP-RT-qPCR分析显示，1-NP暴露后，YTHDF1与FBXW7 mRNA之间的RNA结合显著增加。
5.在MLE-12细胞中，1-NP通过SUMOylation促进ALKBH5泛素化和蛋白酶体降解
我们可以从图5A看到急性1-NP暴露后，MLE-12细胞中ALKBH5 mRNA水平未发生变化。为了分析ALKBH5蛋白还原的潜在机制，如图5B所示，SUMOplot™分析程序发现ALKBH5存在丰富的SUMO化修饰位点。图5C~F的Co-IP分析表明，1-NP暴露促进了ALKBH5和SUMO1之间的相互作用。然而，如图5G~J所示，1-NP暴露后，MLE-12细胞中其他甲基转移酶或去甲基化酶未观察到SUMO化修饰。为了验证SUMO化修饰在1-NP诱导的ALKBH5下降中的作用，作者利用SUMO化修饰拮抗剂TAK-981抑制ALKBH5的SUMO化修饰。结果发现，如图5K~M所示，TAK-981预处理明显缓解了1-NP升高的SUMO1与ALKBH5的相互作用，以及泛素与ALKBH5的相互作用。此外，通过图5N~O的CHX追踪实验发现，1-NP暴露加剧了ALKBH5的降解，TAK-981预处理显著抑制了1-NP诱导的ALKBH5降解。不仅如此，我们还可以从图5P~Q发现，TAK-981处理通过泛素-蛋白酶体方式显著减轻了1-NP诱导的ALKBH5降解。
图5A~Q
6.1-NP通过mtROS介导MLE-12细胞的ALKBH5 SUMO化修饰
接着，作者在MLE-12细胞中评估1-NP对线粒体应激的影响，如图6A~C所示，1-NP明显提高了MLE-12细胞中线粒体伴侣蛋白HSP70和蛋白酶CLPP的表达。然后，测定MLE-12细胞中线粒体膜电位（MMP）和mtROS的水平。图6D~G显示，急性1-NP显著提高了MMP和mtROS的水平，表明1-NP暴露引起MLE-12细胞线粒体应激和mtROS过量产生。图6H~I结果显示。1-NP引起的HSP70和CLPP上调在MLE-12细胞中被线粒体靶向抗氧化剂MT预处理显著抑制。此外，我们可以从图6K~S结果发现，MT预处理显著降低了1-NP诱导的ALKBH5 SUMO化修饰，恢复了1-NP引起的ALKBH5下降和YTHDF1升高，降低了1-NP升高引起的m6A修饰，降低了1-NP诱导的FBXW7上调。这些结果表明，mtROS可能参与了1-NP诱导的ALKBH5 SUMO化修饰和随后的ALKBH5降解过程，最终导致MLE-12细胞中FBXW7 m6A修饰。
图6A~S
7.MT预处理可减轻1-NP诱导的小鼠肺端粒损伤和细胞衰老
然后，作者开始评价MT预处理对小鼠肺组织中1-NP引起的线粒体应激的影响，如图7A~F所示，小鼠肺组织中，MT预处理明显减弱了1-NP引起的线粒体应激、FBXW7上调和ALKBH5下调。图7G~K所示，MT预处理也减轻了FBXW7 mRNA的m6A修饰水平和与YTHDF1的结合水平，还可降低1-NP诱导的ALKBH5的SUMO化修饰。同时，我们可以从图7L~P看到，1-NP诱导的Lamin B1下调被MT预处理逆转。图7Q~S显示，MT预处理可减弱FBXW7诱导的TRF2泛素化降解。此外，如图7T~U所示，补充MT可降低1-NP升高的SA-β-gal阳性细胞数量。并且，如图7V~W所示，MT预处理减轻小鼠肺中1-NP诱导的端粒缩短和1-NP暴露后小鼠肺中MMP、Il-β和Il-6的mRNA水平，并显著升高了Timp1和Timp2 mRNA。
图7A~W
8.MT预处理可减轻1-NP诱导的小鼠肺纤维化
接着，作者开始观察MT对小鼠1-NP诱发肺纤维化的影响，如图8A~B所示，MT预处理显著缓解了1-NP升高引起的体重和肺系数变化。此外，图8C~E显示，MT显著逆转了小鼠体内1-NP引起的肺动态顺应性（Cdyn-min）下调以及吸气阻力（Ri）和呼气阻力（Re）上调。因此，推测慢性1-NP暴露会导致肺损伤和炎症细胞浸润。正如预期的那样，图8F~H显示，MT预处理显著减轻了1-NP引起的小鼠肺损伤和炎症细胞浸润。此外，如图8I~P所示，暴露于1-NP的小鼠肺组织中胶原蛋白和α-SMA表达水平、Col1A1阳性细胞水平以及α-SMA阳性细胞水平均升高。值得注意的是，MT补充剂显著抑制了1-NP引起的肺胶原沉积。这些数据表明，MT对1-NP引起的小鼠肺纤维化具有保护作用。
图8A~P
作者通过之前的研究发现，1-NP会诱发小鼠肺纤维化，但确切的机制仍然难以确定。研究发现，1-NP会诱导小鼠肺部和两种肺泡上皮细胞系的端粒损伤和细胞衰老。1-NP下调了TRF2，并上调了FBXW7。从机理上讲，1-NP导致的TRF2泛素化和蛋白酶体降解依赖于FBXW7的E3泛素连接酶活性。此外，1-NP通过ALKBH5-YTHDF1依赖性方式上调FBXW7 m6A修饰。进一步的分析表明，1-NP促进了ALKBH5 SUMO化修饰和随后的蛋白酶体降解。1-NP还诱发mtROS过量产生。线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO可减轻1-NP引起的mtROS过度产生、ALKBH5 SUMO化修饰、FBXW7 m6A修饰、TRF2降解、细胞衰老和肺纤维化。综上所述，mtROS引发的ALKBH5 SUMO化修饰和随后的FBXW7 m6A修饰对于肺泡上皮细胞中TRF2的降解和细胞衰老不可或缺。本研究为1-NP诱导的肺纤维化提供了靶向干预措施。
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