单核苷酸变异 (SNV) 占遗传变异的 96% 以上，且大约一半变异是非同义的，有可能导致蛋白质功能改变。携带特定 SNV 的精确动物模型对于确定 SNV 是否以及如何导致致病作用以及探索潜在治疗方法至关重要。特别是，斑马鱼因其体型小、繁殖率高、体外发育、透明度高以及与人类的高度遗传保守性而成为研究遗传疾病的理想模型系统。
碱基编辑技术可以将一个核苷酸化学转化为另一个核苷酸。常见的两种碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器（CBE），将 CG 碱基对转化为 TA；腺嘌呤碱基编辑器（ABE），将 AT 碱基对转化成 GC 对，已经广泛应用于植物和动物系统中。
其中，胞嘧啶碱基编辑可用于在细胞和模型生物（如斑马鱼）中进行精确的单核苷酸改变，这对于研究人类疾病非常有价值。CG 到 TA 的转变主要由胞嘧啶的自发脱氨引起，约占已知人类致病性 SNV 的一半，理论上，CBE 应该能够生成带有这些变化的模式生物。但实际上，即使是最先进、最有效的 CBE 也会受到相邻基序的影响。这限制了它们在模拟疾病相关突变中的使用。
基于此，华南师范大学联合南方医科大学的科研团队开发了一种针对斑马鱼的优化胞嘧啶碱基编辑器 zevoCDA1，可提高各种 DNA 环境中的编辑效率，并减少原间隔区相邻基序施加的限制。
此外，研究人员还创建了 zevoCDA1-198，其编辑窗口更窄，只有五个核苷酸，可最大限度地减少脱靶效应。
相关研究成果以“Cytosine base editors with increased PAM and deaminase motif flexibility for gene editing in zebrafish”为题，发表在 Nature Communications 期刊。
研究人员根据斑马鱼的密码子偏好优化了 evoCDA1-BE4max，创建了 zevoCDA1-BE4max，优化后的编辑器克服了序列上下文偏好的限制，在所检查的 12 个目标位点中，zevoCDA1-BE4max 在所有含有 TC、AC、CC 和 GC 基序的位点都实现了 C 到 T 转换。研究发现 zevoCDA1-BE4max 的编辑效率大大超过了之前两种编辑器 zAncBE4max 和 evoCDA1-BE4max 的编辑效率。zevoCDA1-BE4max 主要工作窗口范围是 Cas9 靶位点 PAM 远端的位置 1 到 9，这说明新的编辑器打破了 zAncBE4max 对 CC 和 GC 位点的限制，并可以在斑马鱼的任何序列环境中靶向胞嘧啶。
图 | 优化的编辑器 zevoCDA1- BE4max 介导的所有序列环境下的胞嘧啶碱基编辑
之前的研究已经设计了一种相对灵活的碱基编辑器 SpRY-CBE4max，用于靶向斑马鱼基因组中几乎所有的 PAM 序列。然而，SpRY-CBE4max 也包含了序列上下文偏好的限制，几乎不编辑 GC。基于上述用 zevoCDA1-BE4max 克服序列偏好的成功，该研究团队接下来开发了 zevoCDA1-SpRY-BE4masmax。
使用 30 个 sgRNA 靶向 18 个基因中的非规范 PAM，研究人员评估了 zevoCDA1-SpRY-BE4max 在每个胞嘧啶位点的碱基编辑活性。结果显示，在主要编辑窗口内（位置 1-9，在 Cas9 靶位的 PAM 远端），几乎所有 NC 位点都发生了 C 到 T 的碱基转换，与 SpRY-CBE4max 相比，NRN 和 NYN PAM 的编辑效率明显更高。值得注意的是，SpRY-CBE4max 对大多数具有 NYN PAM 的靶标表现出最小的活性——仅有效编辑了 23 个胞嘧啶中的 2 个，效率超过 25%。相比之下，zevoCDA1-SpRY-BE4max 成功编辑了其中 10 个相同的位点，效率从 25% 到 90% 不等。
与 zevoCDA1-BE4max 相比，zevoCDA1-SpRY-BE4max 的插入/缺失率更低，但编辑效率相似。表明 SpRYCas9 的 PAM 灵活靶向与 zevoCDA1 编辑器的结合提供了高效率和保真度，同时缓解了大多数碱基编辑器先前限制性的序列上下文偏好。
研究团队接下来将这个优化过的编辑器实际应用在斑马鱼疾病模型构建上，成功证实了人类单核苷酸突变在斑马鱼中的致病性。这些结果表明，zevoCDA1-SpRY-BE4max 有潜力作为一种灵活和准确的碱基编辑器运用于疾病模型的构建。
图 | 通过 zevoCDA1- SpRY-BE4max 对非典型 PAM 位点的高效胞嘧啶碱基编辑
以上研究成功编辑斑马鱼基因组中的胞嘧啶，为了再次提高编辑精度，研究人员利用已建立的缩小编辑窗口的策略针对 zevoCDA1-SpRY-BE4max 进行设计。首先，删除了 zevoCDA1 和 SpRYCas9 之间的连接子序列得到 zevoCDA1-NL，随后进一步从 zevoCDA1-NL 中去除核输出信号（NES）序列得到 zevoCDA1-198。zevoCDA1-NL 和 zevoCDA1-198 的编辑窗口分别缩小到 1 到 7 和 1 到 5 位，zevoCDA1-NL 和 zevoCDA1-198 对每个位点主要编辑窗口内最活跃胞嘧啶的编辑效率与 zevoCDA1-SpRY-BE4max 相当。
研究人员应用得到的窄窗口变体在斑马鱼中精确创建了 Axenfeld–Rieger 综合征 (双眼发育性缺陷，ARS)模型。ARS 是一种罕见的、涉及眼前节发育异常的常染色体显性遗传病，可伴有颅面部发育异常、牙齿缺失或小牙、脐部皮肤突出等全身其他器官发育缺陷。
总而言之，该团队的研究工作开发了新的 CBE 编辑器，克服了当前碱基编辑工具的主要局限性，包括克服序列上下文偏差和 PAM 限制，增加精确性，丰富了斑马鱼模拟人类遗传疾病的能力。这种新的基因编辑工具在未来基因功能研究及疾病治疗领域，有着极大的应用潜力。
参考链接：
1. Zhang, Y., Liu, Y., Qin, W. et al. Cytosine base editors with increased PAM and deaminase motif flexibility for gene editing in zebrafish. Nat Commun 15, 9526 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-53735-y
