福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）穿刺样本在各种临床研究，特别是肿瘤研究中发挥着重要作用，通过分析这些样本，研究人员可以探索肿瘤的发病机制、增进对肿瘤免疫微环境（TIME）的理解，并寻找有效的治疗方案。如何在样本量极小的FFPE穿刺样本上进行高通量单细胞转录组测序是一个挑战。
近日，浙大城市学院、浙江大学科研团队在知名学术期刊Advanced Science (IF 14.3)上发表题为《High-throughput Single-nucleus RNA Profiling of Minimal Puncture FFPE Samples Reveals Spatiotemporal Heterogeneity of Cancer》的学术论文[1]。文章中主要使用的技术平台来自M20 Genomics自主研发的VITA平台，对20例实体瘤的FFPE穿刺样本进行单细胞转录组分析，不仅揭示不同癌种间的细胞异质性，还通过免疫治疗前后的配对样本重构肿瘤细胞的发展轨迹，揭示治疗过程中的动态时空异质性，拓展对免疫治疗假性进展的认知。
为将snRandom-seq技术应用在样本量极小的FFPE临床样本（如FFPE穿刺样本）上，研究对实验方法进行优化，以缓解因稀缺FFPE样本中初始细胞核数量有限而导致的细胞捕获率过低等问题。研究在反转录阶段引入一个预索引步骤，独特的预索引引物被分配给来自不同样本的细胞核，再将这些细胞核汇集后继续后续实验，从而实现效率最大化（图1）。经过优化的snRandom-seq技术保持了极高的稳定性和准确性。
图1. 工作流程示意图
研究通过snRandom-seq技术共对20例实体瘤的FFPE穿刺样本进行高通量单细胞转录组测序分析。其中7份治疗前后的配对FFPE穿刺样本分别从3位接受免疫治疗的结直肠肝转移患者患者处取得，用于癌症的时空异质性分析，并与另外3份经由10X Genomics技术分析的新鲜穿刺样本进行技术性能对比（图2）。另外的13份FFPE穿刺样本，收集自包括肝癌（LICA，3个样本）、肺癌（LUCA，1个样本）、肾癌（KICA，1个样本）、乳腺癌（BRCA，3个样本）、胰腺癌（PACA，2个样本）和甲状腺癌（THCA，3个样本）在内的6种常见癌症。研究对这些样本在高通量单细胞转录组测序后产生的数据进行深入分析，包括细胞类型注释、拷贝数变异（CNV）、泛癌种分析和拟时序分析等（图2）。
图2. 实验设计
研究使用3份经由snRandom-seq生成的FFPE穿刺样本数据与使用10× Genomics技术生成的新鲜样本数据进行比较，以评估snRandom-seq的技术性能。结果显示，在snRandom-seq生成的数据中，应激相关基因的表达较低，而10× Genomics生成的数据中则观察到包括应激反应通路在内的较高的样本处理解离相关影响（图3A）。此外，snRandom-seq数据在整个转录本中的覆盖范围更均匀，而10× Genomics生成的转录本数据主要集中在3' 端（图 3B）。两项技术检测到的基因总数水平一致，重叠比例很高，且都检测到一些lncRNA，但由于snRandom-seq的随机引物特性，其鉴定到的lncRNA数量是10× Genomics的6倍（图3C-D）。以上结果表明，优化后的snRandom-seq技术在分析小体积样本时仍能保持较高的基因检测优势。
研究进一步对基于拷贝数变异（CNV）的肿瘤细胞注释进行综合分析。与10× Genomics相比，优化的snRandom-seq鉴定到的肿瘤细胞与正常细胞相比，染色体上的CNV差异显著。两种技术对细胞类型的注释及其覆盖范围显示出良好的一致性和准确性（图3E-F）。此外，优化的snRandom-seq还鉴定出一些在癌细胞中特异表达并与癌症发展和进程相关的lncRNA，可为临床相关lncRNA在TIME内恶性细胞中的表达提供新的见解。
图3. 技术性能评估
优质的单细胞测序平台层出不穷，看来snRandom-seq可以帮助大家在单细胞研究上进行深入挖掘，让我们的研究成果有更多突破。
六种常见癌症的细胞异质性
研究对包括肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌和甲状腺癌在内的6种常见癌症的13份FFPE样本进行单细胞转录组分析，各样本的基因中位数为1,000-2,000个（图4A）。
13个样本整合分析得到的细胞聚类结果如图4B所示，研究不仅发现不同癌症类型中的许多特定细胞群，也检查到一定数量的同质性细胞群，在不同癌症类型中都有一定比例的存在（图4C-E）。在整合细胞聚类结果中，各癌种特异性细胞群主要由通过CNV分析确定的肿瘤细胞组成（图4F），且同一癌症类型的不同样本中的肿瘤细胞也存在异质性。
图4. 六种常见癌症的细胞异质性
常见癌种细胞lncRNA的异质性和反复性表达程序
研究重点分析不同细胞群中差异表达的lncRNA，新发现大量在肿瘤组中特异表达的lncRNA，以及许多lncRNA-mRNA互作对，不同的细胞群表达独特lncRNA-mRNA对，表现出显著的亚群特异性（图5A-C）。这些lncRNA可作为未来研究的基础，为深入了解不同癌症类型的细胞类型和分子机制差异提供依据。
泛癌种分析有助于探索不同癌症类型的异质性和共性。研究在六种常见癌症的13个样本中检查到57个稳健表达程序，发现多个样本中存在复数的反复异质性基因表达程序（recurrent heterogeneous programs, RHPs），并最终确定应激、EMT/侵袭和干性三个表达程序（图5D-E）。六种癌症类型中都观察到应激和干性程序，但只有肺癌、乳腺癌、胰腺癌和甲状腺癌四种癌症类型存在EMT/侵袭程序。
以上结果表明，通过优化snRandom-seq技术处理癌症FFPE样本后，可获得癌症的主要特征，如干性和EMT/侵袭，并发现不同类型癌症之间与其共性或特异相关的基因甚至lncRNA。
图5. 常见癌种细胞lncRNA的异质性和反复性表达程序
基于肿瘤动态时空异质性识别免疫治疗假性进展
研究收集三位结直肠肝转移（CLM）患者在免疫治疗前后的7份穿刺FFPE样本，其中患者1的3份样本来自两个不同的病灶，而患者2和患者3的2份样本来自同一病灶（图6A）。免疫治疗后，影像学显示患者1的肿瘤缩小，而患者2和患者3被评估为疾病进展期（PD），影像学显示肿瘤显著增大（图6D）。研究在单细胞水平上推断了这些肿瘤在治疗前后的发展轨迹，并据此确定了其中一名患者免疫治疗的假性进展。
UMAP图显示，除肝细胞和肿瘤细胞外，患者1的3份样本表现出较高的一致性，且同一患者不同病灶的肿瘤表现出一定异质性（图6B）。研究通过拟时序分析重建了患者1在治疗前后肿瘤细胞的发展轨迹，发现肿瘤细胞从恶性程度较高（0、3、5、13号细胞亚群）向恶性程度较低（10、18、20号细胞亚群）发展的过程（图6C）。
研究对来自患者2的样本展开进一步分析，发现治疗前后患者的肿瘤细胞组成发生重大变化，某些肿瘤细胞亚群特异性出现在治疗后样本中（图6E）。对患者2中识别的恶性细胞进行拟时序分析发现，其恶性细胞存在明显分支，0、4、14号亚群处于轨迹起点，一个分支向1、7、9号亚群发展，另一个分支向6号亚群发展（图6F）。6号亚群几乎完全是在治疗后出现的，这表明肿瘤细胞在治疗期间发生了新的改变。CNV矩阵将患者2的肿瘤细胞分为三个肿瘤亚克隆，亚克隆2和3显示出更清晰的CNV，代表肿瘤细胞的两个发育方向，揭示患者2治疗后肿瘤细胞的持续恶性发展（图6G）。
患者3的肿瘤细胞组成在治疗后也发生重大变化（图6E），研究对患者3进行同样分析发现，其恶性细胞只存在较小分支，大多数恶性细胞主要沿着显性发展轨迹聚集，形成没有显示癌症相关特征富集的4、8号亚群，表明患者3中的恶性细胞亚群对治疗做出了反应，向良性发展（图6F）。亚克隆分析显示亚克隆1在治疗后消失，表明几乎所有恶性肿瘤细胞群都对治疗做出了反应，而治疗后发现的新亚克隆2和3显示的CNV较少，说明虽然患者3的肿瘤病灶在影像学上有所扩大，但实际上肿瘤细胞对治疗有反应并向良性发展，是免疫治疗的假性进展现象（图6G）。事实上，患者3在治疗后肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）呈下降趋势，并在继续接受治疗后出现部分应答（PR）。以上结果从单细胞基因组学验证了患者3免疫治疗的假性进展现象，说明单细胞测序技术有助于判断免疫治疗的效果，可为临床治疗提供参考。
图6. 免疫治疗前后的肿瘤时间异质性
研究优化高通量单细胞转录组测序技术snRandom-seq后，实现对样本量极小的FFPE穿刺样本的处理，且表现出高分辨率、高灵敏的优秀性能结果。研究利用这一技术分析常见癌肿的异质性和同质性，可揭示许多与肿瘤发生相关的lncRNA信息，为深入探索不同癌肿细胞类型差异和发育过程的分子机制提供依据。同时，研究通过拟时序分析构建肿瘤细胞在治疗前后的发展轨迹，可有助于判断免疫治疗的效果，为临床治疗提供参考。
该论文优化的snRandom-seq收录于M20 Seq，其中相关产品VITApilote®高通量FFPE单细胞转录组试剂盒由M20 Genomics自研，可以突破传统单细胞测序技术在处理FFPE样本时的限制，极大扩展单细胞测序技术在临床FFPE样本中的应用范围。产品自推出以来，以其高分辨率高灵敏度性能，为科研工作者开辟更广泛的研究视野，对癌症研究和治疗策略的发展具有重要意义，成为生命科学领域持续创新的重要推动力。
图. VITA高通量FFPE单细胞转录组产品
对FFPE样本单细胞转录组研究感兴趣的老师可以通过电话400-909-6060或者Info@m20genomics.com咨询M20 Genomics技术团队，为您解答更多产品细节，助力您的研究取得突破。
参考文献：
[1] High-Throughput Single-Nucleus RNA Profiling of Minimal Puncture FFPE Samples Reveals Spatiotemporal Heterogeneity of Cancer. Adv Sci (Weinh). 2024 Dec 4:e2410713.
