金浙东，李惠宜，包汶鑫，崔彩霞，袁运生
DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0366
阻断病毒感染是防止病毒传播和治疗患者的有效手段，其中抗猴痘疫苗和抗病毒中和抗体的开发备受关注。目前研究表明猴痘病毒表面存在多个表面蛋白与病毒的感染相关，并可以在动物体内诱导免疫细胞产生具有保护性的中和抗体，如M1R、A29L、A35R、B6R等。通过抗体直接结合病毒表面的A35R或A29L，干扰其调控病毒与宿主细胞的结合，可以有效地抑制猴痘病毒的感染。重组抗原蛋白和稳定表达抗原的工程化细胞株是中和抗体、核酸适配体以及其他相互作用分子开发的重要工具。尤其在生物活性分析方面，表达特定抗原的稳转细胞具有不可替代的功能，也被广泛地应用在候选药物筛选和活性测定。鉴于A35R和E8L两个靶点在治疗猴痘感染模型动物的效果，建立稳定表达猴痘抗原蛋白A35R、E8L的稳转细胞株对于开发靶向A35R、E8L的治疗药物，如中和抗体、小分子激动剂/抑制剂、核酸适配体、多肽等，以及进一步研究A35R、E8L生物学功能都有重要意义。
近日，《生物技术通报》在线发表了题为《表达猴痘病毒表面蛋白A35R和E8L稳转细胞株的构建与应用》的研究报告。本研究构建了稳定表达猴痘病毒（Mpox virus, MPXV）表面蛋白A35R和E8L的稳转细胞株，用于定性或定量分析相应猴痘表面蛋白的抗体或互作分子与细胞表面A35R或E8L结合活性，其对于开发靶向A35R、E8L的治疗药物，如中和抗体、小分子激动剂/抑制剂、核酸适配体、多肽等，以及进一步研究A35R、E8L生物学功能都有重要意义。
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开发阻断猴痘感染的药物具有重要的社会价值。中和抗体在抑制病毒感染和清除体内病毒方面发挥重要的生物学功能，并且已经在多种病毒性传染病的早期阻断和重症治疗方面表现出良好的疗效。A35R和E8L蛋白是治疗猴痘感染的两个潜在靶点，分别定位在细胞外包膜病毒颗粒（EEV）和细胞内成熟病毒颗粒（IMV）表面。已有报道显示，抗痘苗病毒（VACV）A33R（猴痘病毒 A35R 同源基因）蛋白单克隆抗体和抗D8L（猴痘病毒 D8L 同源基因）蛋白单克隆抗体单独使用均具有一定的抑制VACV感染功能，对VACV感染模型动物的治疗方面也都表现出一定的保护效果。这两种单克隆抗体的联合使用已经在MPXV感染模型动物体内显示出比单个抗体更好的协同治疗效果。稳定表达病毒表面抗原的细胞株广泛应用于治疗性中和抗体结合活性的初步分析。研究中，通过给A35R和E8L的N端构建小鼠IgG kappa轻链的信号肽的策略，成功实现重组A35R和E8L通过翻译过程中导入内质网。而A35R蛋白的C末端融合VSV-G的跨膜区的方法，帮助重组A35R蛋白定位在细胞膜上，此外G4SG4S的柔性连接子帮助A35R更加灵活展示在细胞表面。免疫荧光和流式细胞结果都表明重组抗原的表达和定位达到了预期设计的目标。快速筛选出稳定表达A35R或E8L蛋白的工程化细胞也表明本研究中的慢病毒基因的递送系统将编码重组A35R或E8L的DNA以及带有抗嘌呤霉素的抗性基因DNA片段成功整合至HEK-293T细胞基因组中，并形成了稳定的遗传。
设计出带有高效信号肽以及跨膜结构的重组MPXV表面蛋白A35R和E8L，采用慢病毒转染技术将两个编码重组蛋白的DNA片段递送到HEK-293T细胞内，成功插入到HEK-293T细胞的基因组中，形成稳定表达A35R和E8L的稳转细胞。两个MPXV表面蛋白按照设计的目标，实现了细胞表面定位，并筛选出两个可以用于定量分析抗A35R或E8L单克隆抗体结合活性的单克隆细胞株A35-4E3和E8-8。同时，这两个单克隆细胞株也是检测各类靶向A35R和E8L生物分子在细胞表面与相应蛋白结合活性的有力工具，也为更多的同类分子设计提供可供参考的方法。
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