武帅，辛燕妮，买春海，穆晓娅，王敏，岳爱琴，赵晋忠，吴慎杰，杜维俊，王利祥
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0205
植物吸收氮素有三大来源，主要来源是土壤中铵盐和硝酸盐等无机氮，而硝酸盐需要先还原成铵盐才能被进一步利用。氮代谢包含氮素同化、积累和蛋白质合成等，与植物的生长发育和产量品质密切相关。土壤中NO3-和NH4+等形式的无机氮，先被根系吸收后再通过“GS-GOGAT循环”催化生成有机氮形式的谷氨酰胺，才可被植物进一步转化利用。GS是植物体内氮代谢的关键酶，在同化过程中它催化谷氨酸、ATP和NH4+合成谷氨酰胺。植物中GS酶两种主要的GS亚型，一种是细胞质型（GS1）, 一种是质体型（GS2）。在植物中GS1与储存氮源和氮素的转移再利用有关，GS2主要参与硝酸还原产生的氨的同化以及光呼吸过程。植物GS1由多个核基因编码，部分成员已经被分离和克隆出来。本试验根据GS在大豆中的分类（GmGS1α1/2、GmGS1β1/2、GmGS1γ1/2）和染色体上的位置分布重新命名为GmGS1到GmGS8。目前关于大豆GS的报道，除了对其成员的分类还发现相比于其他组织部位GmGS3、GmGS4、GmGS5和GmGS6的表达量在根瘤中较高，还通过对蛋白原核表达的功能研究发现，GmGS4主要参与大豆根瘤的氮代谢。
在早期的相关研究中发现，植物GS响应外界环境中铵盐形态的氮素，GS不仅负责植物氮的同化利用，其本身还在mRNA和蛋白水平上响应外界氮刺激。植物中不同物种的GS家族，当受到外界环境中铵盐形态的氮素刺激时，GS各成员具有差异性响应。而在大豆中进行铵盐处理的报道鲜有研究，故用不同浓度的氯化铵作为唯一氮素来源，研究大豆GS基因家族对铵盐的响应具有重要意义。
在非生物胁迫中，盐胁迫导致的渗透胁迫是降低全球作物生产率的最主要原因之一，会大大降低农作物的产量。而植物的GS不仅能响应环境中的氮刺激，还在响应盐胁迫方面有着重要作用。大豆起源于中国，作为重要的粮、油、饲兼用作物，对外依存度高是关乎国家粮食安全的战略问题。目前国外已培育出众多优势基因集合的转基因大豆，而我国作为大豆起源国，资源种类丰富，在转基因大豆育种方向上的研究仍有很大发展空间。
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本文主要包括以下几部分内容：
2.1 大豆GS基因家族的鉴定
2.2 大豆GS基因结构和蛋白理化性质分析
2.3 大豆GS基因保守结构域和基因系统进化分析
2.4 大豆GS启动子顺式作用元件
2.5 大豆GS表达模式分析
2.6 铵盐处理下大豆GS基因RT-qPCR分析
2.7 盐胁迫下大豆GS基因RT-qPCR分析
3 讨论
氮是驱动植物生长和发育的重要元素，以硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）为主的无机氮是植物最主要的氮源。硝酸盐需要先被还原为铵盐，才能进一步完成同化过程，相比之下铵盐是更高效的氮源。然而过量的铵盐往往会造成铵毒害，使植物生长受到抑制。植物GS表达不仅有组织器官特异性，还受发育因子和环境中的光、氮、二氧化碳等的影响。此次试验中用不同浓度的氯化铵作为唯一氮素处理，进一步证实大豆GS家族参与铵盐态氮素响应，对整体研究调控大豆生长发育过程具有重要意义。荧光定量qPCR结果表明: 在不同浓度的氯化铵处理后，GmGS1响应高浓度的铵盐，其余GmGS成员都可能主要在后期响应低浓度的铵盐处理。而在低浓度铵盐处理下，后期响应程度最大的是GmGS4、GmGS5和GmGS7。
植物GS能增强抗非生物性胁迫的耐逆性，逆境条件可以刺激植物体内GS的活性和相应基因的表达，从而增强植物的耐受性，而在大豆中GS家族对盐胁迫的响应鲜有研究。在本次大豆GS响应外界环境的研究中继铵处理后，对有显著响应的基因用盐胁迫转录组数据做进一步的筛选，挑选出可能响应盐胁迫的基因GmGS5和GmGS7进行盐胁迫响应分析。通过荧光定量qPCR检测基因在根、茎、叶3个不同部位的表达情况，荧光定量qPCR显示：在高盐胁迫处理后，GmGS5在根、茎、叶组织中表达量均下调；GmGS7 在根、茎组织中表达量上调。GmGS7属于质体型GmGS，与拟南芥等质体型GS一样参与盐胁迫响应。
作为非生物胁迫之一的盐胁迫，随着全球盐碱地的不断增加，正逐渐转变成非生物胁迫的主要因素，所以研究大豆GS对逆境胁迫的响应具有重要意义。GmGS7对低铵和高盐胁迫产生应答，不仅为人工选择大豆氮素代谢途径的研究提供新的靶标思路，还可为培育耐盐大豆新品种奠定理论基础，可能对提高大豆品质与产量具有重要意义。
从大豆中共鉴定出8个谷氨酰胺合成酶基因（GmGS1-GmGS8）。GmGSs成员均匀地分布8条染色体上，在氨基酸和保守基序方面GmGS1-GmGS6所含数量相同为一类，GmGS7和GmGS8所含数量相同为另一类，各类在结构上存在高度的相似。在氯化铵作为唯一氮源的铵盐诱导过程中，响应最显著的是 GmGS4、GmGS5和GmGS7，受诱导表达上调。在盐胁迫处理中，GmGS7受盐胁迫诱导表达，GmGS5被胁迫抑制。GmGS7在根中不仅响应低浓度铵盐处理，还在盐胁迫前期参与响应。
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