Nature immunology┃类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞异质性的驱动因素
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科学
2024-11-13 19:03
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类风湿关节炎（RA）是一种主要表现为关节受累的系统性自身免疫性疾病，其特征是滑膜衬里细胞（与充满滑液的关节腔相接）和滑膜衬里下层（血管增生和白细胞浸润增加）均发生增生。衬里和衬里下层的成纤维样滑膜细胞（FLS）均发生增殖和活化，进而刺激血管生成、产生促炎细胞因子和趋化因子，并侵入相邻的关节软骨和骨骼。活化的FLS表达主要组织相容性复合体（MHC）II类分子，这与滑膜炎症相关，并与疾病活动度相关。HLA-DR+ FLS表达可溶性介质，包括促炎细胞因子白细胞介素IL-6和IL-15以及趋化因子CCL2、CXCL9和CXCL12，以及粘附分子如ICAM1和VCAM1，这表明它们与白细胞之间存在相互作用。为了支持这一可能性，先前的体外研究表明，HLA-DR+ FLS能够将抗原呈递给CD4+T细胞。此外，FLS产生上述促炎趋化因子可能作为一种前馈机制，进一步促进多种免疫细胞类型的募集。事实上，最近使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对RA患者滑膜组织的细胞构成进行的研究发现，造血和非造血来源的迁移细胞和常驻细胞混合存在，包括不同的CD4+和CD8+ T细胞亚群、髓系细胞和FLS。这些观察结果表明，RA滑膜中FLS的活化状态可能由多种浸润的先天性和适应性免疫细胞驱动，并且这种调节最终会影响疾病的发病机制。
2023年6月，来自美国纽约凯特林研究所Alexander Y. Rudensky教授团队在Nature immunology（IF：27.7）杂志上发表了题为：“Drivers of heterogeneity in synovial fibroblasts in rheumatoid arthitis”的研究论文。在本研究中，作者通过配对单细胞RNA测序（scRNA-seq）和转座酶及染色质测序（ATAC-seq），以及体外模拟FLS对关键免疫细胞衍生的促炎细胞因子的转录反应，对发炎的RA滑膜中FLS状态的谱系以及观察到的异质性背后的驱动因素进行深入研究。作者还采用了空间转录组（ST）分析和多重成像技术，绘制了FLS异质性和转录反应的空间分布图。研究结果表明，在空间上受限的FLS对三种白细胞衍生的细胞因子（肿瘤坏死因子TNF、干扰素IFN-γ和IL-β）的反应或缺乏反应，驱动了发炎的RA滑膜中形成四种不同的FLS状态.
本研究主要揭示了RA滑膜中成纤维样滑膜细胞（FLS）谱系以及FLS异质性的驱动因素。为了验证RA患者关节炎症是否会导致细胞因子活化的FLS显著扩增的可能性，作者试图对不同程度炎性浸润的RA组织进行单细胞分辨率下的FLS转录组和染色质表征。所有患者均确诊为血清阳性（抗环瓜氨酸肽抗体CCP+）RA，符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟分类标准。在对scRNA-seq数据进行广泛过滤和Harmony批次校正后，作者获得了包含36,719个FLS的14个簇（图1a）。利用已建立的标志物（图1b），作者确定了衬里层和亚衬里层簇以及一个中间簇。事实上，通过逐个评估簇的相关性，作者定义了四种具有不同推测功能的FLS状态，以及两种介于状态之间的中间簇（图1c,d）。已确定的静息衬里FLS状态与缓解期RA患者衬里FLS的转录特征相似，并与多条涉及细胞生长和增殖的途径相关（图1d）。为了更深入地了解淋巴细胞浸润程度如何影响FLS状态，作者评估了滑膜样本中FLS状态的相对丰度（图1e）。在白细胞（CD45+）比例较高的组织中，活化亚衬里和活化衬里状态扩张，而静息衬里状态收缩（图1f）。静息亚衬里FLS的比例相对恒定，这进一步强调了这些FLS可能具有类似祖细胞的作用，其分化潜能有待进一步研究。值得注意的是，即使健康滑膜中也存在活化亚衬里FLS，这让作者推测它们可能具有尚未明确的稳态功能。活化FLS状态的比例与白细胞浸润之间的相关性表明，这些状态可能由细胞类型间的相互作用驱动，并且可能处于动态变化中。鉴于作者怀疑FLS活化状态是对局部浸润白细胞相互作用的短暂反应，作者使用Palantir17进行了轨迹分析，以更好地了解FLS状态之间的关系（图1g）。从健康滑膜样本静息亚衬里中的细胞开始，终点既存在于活化衬里也存在于静息衬里，但不存在于活化亚衬里，这表明后者可能是一个中间状态。这支持了FLS可以从亚衬里分化到衬里，但不能反向分化的观点。活化亚衬里中缺乏终点与先前分析一致，该分析表明CXCL12+ FLS是RA FLS轨迹中的中间状态。要全面了解人类FLS分化，还需要进一步研究。![]()
图1 RA滑膜中的FLS状态显示免疫细胞激活
以往基于细胞群体的研究表明，人体不同解剖位置的成纤维细胞具有独特的转录特征，且其“拓扑结构”具有可遗传的印记。然而，作者对PI16+FLS所表现出的保守的“通用成纤维细胞”特征的观察表明，不同病理过程影响的不同解剖位置的组织成纤维细胞的疾病诱导状态之间可能存在重叠。因此，作者接下来探索了所确定的FLS状态是否仅独特于滑膜或RA相关炎症，或者是否也存在于其他疾病和组织中观察到的成纤维细胞群体中（图2）。作者观察到结直肠癌中的炎症相关成纤维细胞与活化衬里FLS状态之间存在转录相似性。后一种FLS状态也与能够成功愈合的糖尿病足溃疡中成纤维细胞的转录状态相似。相比之下，活化亚衬里FLS在转录上与结肠中的ACTA2+肌成纤维细胞和WNT5B+成纤维细胞，以及与健康皮肤相比，在硬皮病中扩张的两种皮肤成纤维细群体相似。因此，FLS群体组成和FLS状态谱的炎症诱导扰动也存在于一系列病理过程中其他组织的成纤维细胞中。![]()
图2 FLS和非滑膜成纤维细胞在组织和疾病中共享功能基因表达程序为了深入了解可能调控所观察到的FLS状态的转录因子（TFs）和上游信号通路，作者分析了配对的scATAC-seq（单细胞ATAC测序）数据集。通过无监督聚类和谐音（Harmony）批次校正，作者得到了包含衬里FLS和亚衬里FLS的12个簇，共包含30,963个FLS（图3a）。
通过scRNA-seq分析确定的不同FLS状态占据了scATAC-seq的UMAP（统一流形近似与投影）图中的不同区域（图3b,c）。为了推断在确定的FLS状态中TF活性的差异，作者使用了chromVAR24进行了染色质可及性变异分析。对于此分析，作者使用配对的scRNA-seq数据作为过滤器，仅评估在相应状态中由超过20%的细胞表达的TF家族的基序。作者观察到，在开放染色质位点内，不同TF结合基序的富集程度在状态之间存在显著差异（图3d,e）。活化亚衬里FLS状态的特征性开放染色质位点富含IRF、STAT和NF-κB家族基序，暗示着一组不同的炎症通路，如IFN和TNF信号，在建立该状态中发挥作用。与这两种主要的炎症激活类型相反，静息衬里FLS状态的特征在于同源异型盒TF家族成员基序（例如ZFHX3）的可及性，这些成员除了作为组织发育和组织的主要调节因子外（包括FLS的关节特异性起源），还控制成纤维细胞的静止状态（例如PRRX1）。这些结果表明，发炎的RA关节中FLS的不同状态依赖于免疫细胞衍生因子的局部刺激，首先是促炎细胞因子，或避免这些炎症暴露。![]()
图3 FLS状态的染色质可及性分析揭示了不同的转录调控为了验证上述可能性并阐明炎症因子对FLS状态转录组的影响，作者试图通过建立细胞类型特异性的细胞因子诱导程序来解析其复杂的转录组。为了识别免疫细胞衍生的细胞因子转录反应及其对FLS状态特异性转录组独特特征的贡献，作者采用候选促炎细胞因子和其他因子对培养的FLS进行体外刺激。这些FLS已知在后续传代中会迅速丧失其表型异质性。在这些实验中，作者从四个RA滑膜组织样本中分离出FLS，在将来自所有供体的FLS合并并进行三次重复刺激之前，对它们进行了三次传代培养。作者用与RA相关的三种主要细胞因子（TNF、IFN-γ和IL-1β，单独或组合使用）刺激FLS，并使用RNA-seq评估由此产生的基因表达变化（图4a）。作者发现，用TNF和IFN-γ体外刺激FLS可诱导包括CCL2和IL6在内的基因表达，这些基因在体外分离的活化亚衬里FLS中高表达（图4a）。将上述体外分析确定的细胞因子反应基因特征映射到作者的scRNA-seq数据集上，发现活化衬里FLS状态中FLS特异性细胞因子反应基因特征的表达最为显著（图4b）。相比之下，活化亚衬里FLS状态中的主要细胞因子反应特征与TNF和IFN-γ的双重刺激相关。值得注意的是，静息状态几乎缺乏细胞因子反应基因特征的表达。已有研究表明，由血管内皮表达的配体诱导的Notch信号在RA滑膜中血管周围和亚衬里FLS的分化中起重要作用。这引发了一个问题，即Notch信号是否可能调节亚衬里内FLS对促炎细胞因子的转录反应。为了探索这种可能性，作者研究了在存在或不存在板结合Notch配体Delta 4（DLL4）的情况下，用TNF、IFN-γ和IL-1β刺激FLS引起的基因表达变化。这一分析显示，对所有三种细胞因子的转录反应均受到全局抑制（图4c）。接下来，作者通过免疫荧光成像检测了活化TFs STAT1和cJun（分别是IFN和IL-1β信号的关键下游靶标）在滑膜衬里的细胞因子信号，寻找证据。作者在滑膜衬里中发现了许多pSTAT1+ FLS，并发现其中一些细胞也被核cJun染色（图4d）。值得注意的是，滑膜中cJun+或pSTAT1+细胞的大多数都是FLS，这表明这些间质细胞是滑膜中主要的细胞因子信号靶标（图4e）。这使作者能够将观察到的TF基序与细胞因子模拟在调节染色质可及性位点上的情况与通过体外分离细胞的scATAC-seq分析揭示的FLS状态中的情况进行交叉引用（图4f）。这一观察结果很可能是由于IL-1β、IFN-γ和TNF联合暴露导致这些元件亚集中STAT可及性的相对降低，而相应的转录水平并未受到显著影响。综上所述，这些转录组和表观基因组的分析支持TNF和IFN-γ的组合刺激在促进活化亚衬里FLS状态的作用，以及TNF、IFN-γ和IL-1β的三重组合在建立活化衬里FLS状态中的作用。![]()
在RA滑膜中，不同种类的免疫细胞侵入并局部产生炎症细胞因子，导致炎症滑膜中不同FLS状态以空间方式形成。为了确定RA滑膜中FLS状态的空间分布，作者使用10x Visium平台对另外两个炎症RA滑膜样本进行了空间转录组（ST）分析，并结合相邻组织切片的多重免疫荧光（IF）成像。对进行ST分析的切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，结果显示有明显的淋巴细胞聚集以及丰富的滑膜衬里层（图5a）。作者将ST数据集与作者的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析相结合，以绘制来自四种FLS状态的转录特征。结果显示，无论是在衬里层还是衬里下层，静息态和激活态的FLS似乎都没有明确的区域界限而相互混杂（图5b）。接下来，作者将体外FLS特异性细胞因子应答基因特征应用于空间基因表达图。作者发现，IL-1β应答特征主要定位于衬里层，而TNF、IFN-γ及其组合的应答特征则更为分散（图5c）。由于每个RNA捕获位点可能包含多个细胞，作者通过创建一个仅包含基于最近对RA滑膜的scRNA-seq分析确定的FLS特异性表达的基因的改良IL-1β应答基因特征，确认了在ST分析中观察到的IL-1β应答基因特征是由FLS贡献的。
为了进一步表征滑膜微环境，作者对ST数据集应用了主题建模，以识别每个位点内的特定细胞类型，并将这些细胞类型与作者的FLS状态和细胞因子应答基因特征进行共定位（图5d,e）。结果表明，来源于已发生炎症反应的常驻巨噬细胞或浸润性激活单核细胞的IL-1β在衬里FLS激活中发挥作用。这些结果表明，细胞因子和发育信号通路在炎症RA滑膜内塑造了多个空间上不同的微环境。
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图5 细胞因子信号传导在空间上受到限制与细胞定位相关作者建立了RA中FLS状态异质性的空间图谱，该图谱由其独特的转录特征和由免疫细胞衍生的促炎细胞因子局部差异暴露驱动的染色质特征所定义。值得注意的是，衬里层和衬里下层中的细胞因子环境和FLS激活状态存在差异，这表明作者需要更好地了解这些微环境及其差异的功能意义。考虑到RA中观察到的滑膜异质性显著，以及作者的多组学数据集仅来自接受传统合成疾病修饰抗风湿药物治疗的抗环瓜氨酸肽抗体阳性（CCP+）患者的组织样本这一事实，有必要根据本研究建立的框架进一步定义滑膜微环境。所得数据集将成为未来研究的宝贵资源，通过整合本文描述的炎症滑膜成纤维细胞的独特和共同特征与其他疾病相关信号（如补体激活和通过HLA-DR潜在的抗原呈递）来探究RA的发病机制。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41590-023-01527-9Smith, Melanie H., et al. "Drivers of heterogeneity in synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis." Nature Immunology 24.7(2023):1200-1210. doi:10.1126/articles/s41590-023-01527-9校对：Evan Flle
排版：xiaowu
封面来源：Freepik
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