J Immunother Cancer〡肺鳞癌中免疫治疗与免疫相关不良事件的重编程机制

为了进一步验证上述假设，研究随后探讨了在不同治疗反应和免疫相关不良事件（irAE）亚组中T细胞亚群的分布和功能。根据已发表的标志物和细胞标记物，确定并注释了七个CD8⁺T细胞亚群和四个CD4⁺T细胞亚群（图2A、B）。

为了确定LUSC中特征化的T细胞亚群是否类似于T细胞的功能表型，基于已建立的基因签名对单个细胞进行了细胞毒性和耗竭评分。与先前的研究一致，CD8⁺杀伤细胞免疫球蛋白样受体阳性酪氨酸激酶阳性自然杀伤细胞样（KIR⁺TXK⁺NK^-like）细胞和CD8⁺末端耗竭T细胞（终末Tex）细胞分别显示了最高的细胞毒性和耗竭评分（图2C）。CD4⁺干扰素γ阳性T辅助细胞/T辅助1型细胞（IFNG⁺Tfh/Th1）细胞在细胞毒性和耗竭评分上均较高，而CD4⁺肿瘤坏死因子受体超家族成员9阳性调节性T细胞（TNFRSF9⁺Treg）细胞显示了最高的耗竭评分。在CD8⁺T细胞中，作者发现PR肿瘤显示了较高比例的粒磷蛋白K阳性早期效应记忆（GZMK⁺Tem）细胞和KIR⁺TXK⁺NK^-like细胞，而这些细胞在治疗后SD肿瘤中较少见（图2D）。CD8⁺末端Tex细胞和CD8⁺白细胞介素7受体阳性记忆T细胞（IL7R⁺Tm）细胞在ICI前肿瘤中富集（图2D）。在比较CD4⁺T细胞亚群时，发现PR肿瘤中的表皮生长因子阳性组织金属蛋白酶抑制因子1阳性记忆T细胞（AREG⁺TIMP1⁺Tm）细胞和核苷二磷酸激酶1阳性和C-Cmotif趋化因子受体4阳性T细胞（NME1⁺CCR4⁺T）细胞丰度较高，而CD4⁺IFNG⁺Tfh/Th1细胞较低。但作者在irAE和非irAE患者之间的T细胞亚群丰度中未观察到显著差异。考虑到CD4⁺T细胞相对较少，接下来检查了CD8⁺T细胞亚群中与治疗反应和irAE相关的功能表型变化。ICI治疗肿瘤中大多数CD8⁺T细胞亚群的细胞毒性评分上调，耗竭评分下调（图2E）。在黑色素瘤和肾细胞癌模型中，原始耗竭CD8⁺T细胞，其长期存在，分化为终末耗竭表型，而表现出后一表型的CD8⁺T细胞在响应抗PD-1时更有效地杀死靶向肿瘤细胞。在来自ICI治疗样本的CD8⁺GZMK⁺早期Tem细胞中，作者观察到来自PR肿瘤细胞中终末耗竭基因签名的显著富集，并通过GSEA分析观察到来自SD肿瘤细胞中原始耗竭基因签名的显著富集（图2F）。

有趣的是，在irAE组中的比较中，来自irAE患者肿瘤的CD8⁺GZMK⁺早期Tem细胞显示出原始耗竭基因签名的显著富集，而非irAE患者肿瘤显示出终末耗竭基因签名的显著富集（图2G）。

综上所述，这些发现表明CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的几个亚群在PR肿瘤中更为普遍，CD8⁺GZMK⁺Tem细胞的T细胞耗竭状态在治疗反应和irAE亚组中存在差异。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）据报道在肿瘤微环境（TME）中扮演双重角色，包括炎症、血管生成和肿瘤细胞杀伤等功能，但它们与免疫相关不良事件（irAEs）之间的关联大多仍然未知。因此，作者从完整数据集中分析出六个巨噬细胞亚群，并探讨它们与治疗反应和irAEs的关系（图3A）。基于高表达基因和先前的文献，作者对巨噬细胞亚群进行了注释（图3B）。为了更好地理解这些亚群的功能表型，我们分析了M1、M2、血管生成标志物和抗原刺激的炎症反应的基因表达。但是并没有观察到M1和M2标志基因在这些亚群中的明确二分化表达。分泌性磷酸化蛋白1阳性巨噬细胞（宏观SPP1⁺）显示出对血管生成基因签名和抗原刺激的炎症反应的优先表达（图3C）。另外，SPP1和C1QC共表达巨噬细胞亚群（宏观C1QC⁺SPP1⁺）也高度表达这两个标志物（图3C）。重要的是，宏观SPP1⁺在irAE患者的肿瘤中的频率较高（图3D），这提示宏观SPP1⁺介导的炎症在TME中与irAEs可能存在潜在联系。在PR肿瘤中观察到宏观C1QC⁺的显著减少，而该细胞浸润在肿瘤中表明明显的清晰细胞肾癌复发（图3D）。

同时，基因集富集分析显示了与巨噬细胞活性各个方面相关的通路的多样化富集，包括血管生成、炎症反应和抗原处理呈现（图3E、F）。此外，肿瘤坏死因子α信号通路（TNF-α）和肿瘤生长因子β信号通路（TGF-β）在SD和irAE患者的几乎所有巨噬细胞亚群中均有富集（图3E、F）。

考虑到TNF-α是由巨噬细胞分泌的并在癌症中的炎症调控中扮演关键角色，本文的数据表明，TNF可能是TME中的一个关键调节因子，促进irAEs并降低ICI治疗的有效性。

为了将在肿瘤中的观察结果与irAE影响器官/组织中的免疫事件联系起来，作者对来自ICI心肌炎患者的术前/治疗中肿瘤样本、irAE受影响和未受影响组织活检样本进行了批量RNA-seq分析，以及来自ICI脑炎患者的脑组织样本进行了批量RNA-seq分析。作者通过CIBERSORTx将这些批量转录组数据解卷积为免疫细胞类型的分数，并发现irAE受影响样本和治疗中肿瘤中含有高比例的巨噬细胞，其增加幅度比CD8⁺ T细胞更为显著（图5A）。此外，作者观察到在治疗中肿瘤和irAE受影响样本中，通过NFKB途径的炎症反应和TNFA信号通路得分增加（图5B），然而，TGF、IL-6、IFN和IL-2途径的升高程度不及这两条途径。

图5 识别irAE影响器官中的免疫细胞部分和TNF通路上调

接下来，作者提出ICI诱导的免疫细胞向irAE受影响组织或肿瘤组织的迁移可能通过血液中细胞因子的变化来反映。作者在湖南省肿瘤医院收集了一个独立的肺鳞状细胞癌（LUSC）队列1。患者的中位数（IQR）年龄为62岁（58.5-65岁），14名患者（93.3%）为男性。比较了ICI治疗第二个周期后，LUSC患者血浆中TNF、IL-2、IL-6和TNF的变化情况（总共15例；8例有irAE，7例无irAE；12例反应者，3例非反应者）。一致地，ICI治疗后irAE患者的TNF变化显著高于无irAE患者，而反应者和非反应者之间的比较不显著（图6A、B）。

鉴于队列1的样本量较小，作者接着收集了来自前瞻性多中心研究和另一个较大样本量（n=115）的LUSC患者队列，队列2的发布数据，以验证这些观察结果的稳健性。作者分析了由Olink平台生成的40例患者血清样本的蛋白组学数据，在ICI治疗前后的变化。同样地，TNF表达在发展irAE的患者中显著升高，而在反应者中没有显著变化。队列2是在北京协和医学院收集的，患者血浆中的TNF表达水平通过化学发光技术确定。通过比较ICI治疗前后TNF表达的差异，观察到irAE患者中TNF差异增加（图6C）。而在比较反应者和非反应者时，没有观察到显著变化（图6C）。