Lab Chip︱钱旭/Tony Hu联合综述基于CRISPR的伴随诊断技术开发应用于资源匮乏环境

文摘   科学   2024-11-10 18:38   北京  



2024年9月,浙江省肿瘤医院钱旭和美国杜兰大学Tony Hu教授团队在Lab on a ChipIF:6.1)杂志上发表了题为“CRISPR for companion diagnostics in low-resource settings”的综述论文,系统综述了基于规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的伴随诊断技术开发及其在资源匮乏环境中的应用,特别是在结核病、肿瘤及新发传染病诊断中的潜力 [1]。本文讨论了基于CRISPR的诊断检测方法(CRISPR-Dx)包括样本处理、靶标扩增、多重检测设计及信号读出等多个方面,已经或可能应用于即时检测(point-of-care testing,POCT)和自我检测(self-testing)的能力,并进一步探讨了在资源匮乏环境中的应用所面临的挑战和未来发展的机遇。




CRISPR最初是在细菌和古菌中发现的一种免疫系统,是原核生物的一种自我保护机制。该序列与CRISPR相关蛋白(Cas)组成CRISPR/Cas系统,具有高效的反式切割活性,近年来广泛用于开发 CRISPR-Dx 检测。常用的Cas系统有Cas13、Cas12、Cas9和Cas14,具有不同的特性,包括不同的CRISPR RNA序列结构、原间隔序列临近基序、靶标特异性和切割活性等。例如,SHERLOCK[2]和DETECTR[3]平台分别利用Cas13和Cas12的反式切割活性进行信号放大,实现高灵敏度检测。将此类检测技术应用于资源匮乏环境中应尽可能符合 REASSURED(real-time connectivity, ease of specimen collection, affordable, sensitive, specific, user-friendly, rapid, equipment-free, deliverable to end-users, and environmentally friendly) 标准,即能够实时连接、标本易于采集、经济实惠、兼具灵敏性与特异性、用户友好、快速、无设备依赖、易于保存运输和分发,并且环境友好。


 图一 在不同场景下可应用的检测方法


CRISPR检测技术的开发在方法设计环节中,有多种选择可以使检测方法更适用于特定的应用场景。首先,研究人员使用合成或模拟样品测试信号放大和读出方法,以评估检测对其生物标志物靶标的灵敏度和特异性,并确定是否需要不同的方法或靶标预扩增步骤来优化性能。如使用临床标本,研究人员会优化靶材的分离程序,以改善靶标检测并简化整体检测工作流程。最后,成功的检测方法可以整合应用到多重检测或POCT中。CRISPR-Dx 检测主要有以下优势。

1、靶标扩增:为了检测低丰度的核酸靶标,CRISPR检测可以结合等温扩增方法,如重组酶聚合酶扩增和环介导等温扩增。这些方法不需要热循环仪,可以在较宽的温度范围内有效工作,适合资源匮乏环境。

2、信号读出多样化:CRISPR检测的信号读出方法包括荧光、比色法和电化学方法等,可以适用不同的检测需求,提供直观、易读的检测结果。

3、无核酸扩增方法:不采用核酸预扩增步骤的检测方法,提高了检测的便捷性和速度。设计一个反馈回路,如CRISPR-Cas-Only 扩增网络,通过产生正反馈回路实现指数级信号放大,采用单一酶,反应条件简单;另一种常用方法是使用微升或毫微升液滴或微腔来减少反应体积,从而有效增加反应物浓度,适用于高灵敏度和定量检测,但此方法需要额外的设备和人员培训。

4、样本处理简化:一些CRISPR检测方法,不需要复杂的样本处理过程,可以直接在采集的样本(如血液、唾液或鼻咽拭子)中检测目标核酸序列而无需进行核酸提取,大大简化了检测流程。

5、多重检测:CRISPR技术允许在一次检测中同时识别多个靶标,因而对同时检测多种生物标志物、提高诊断准确性有较大的帮助。例如,在传染病筛查中可以同时检测多种病毒的核酸序列。

6、CRISPR集成微流控设备和可穿戴设备等:大多数CRISPR-Dx 程序,包括核酸提取、扩增、Cas 反应、信号转导和读出的步骤,都可以集成到定制的微流控设备中。此外,一些 CRISPR-Dx 检测已完全集成到可穿戴设备中,如带有冻干 CRISPR 传感器的口罩和微针贴片,这些可穿戴设备具有快速、便携的特点,适用于特定疾病风险的快速评估。


图二 基于CRISPR-Dx的结核分枝杆菌检测方法


在实际应用中,以结核病为例,传统的诊断方法往往耗时或者难以检出难诊结核。世界卫生组织发布的《2024年全球结核病报告》[4]中指出,据估算2023年全球有1080万新发结核病患者,2023年全球因结核病死亡人数为125万,结核病防治任务仍然很重。2023年联合国大会结核病高级别会议设定2027年新的全球目标包括新诊断患者首诊使用快速诊断技术的比例达到100%。在一项研究中开发的超灵敏CRISPR/Cas12a荧光检测系统(CRISPR-TB),能够通过检测血液样本中的Mtb-cfDNA(结核分枝杆菌-病原体游离DNA)灵敏诊断结核,包括难诊结核,在两小时内就可以提供结果,并通过检测来自非艾滋病毒感染的儿童和成人血液样品(Eswatini队列)及处于严重免疫抑制状态状态下的艾滋病毒共感染儿童纵向样本(PUSH队列)验证了该检测方法的诊断灵敏度和特异性等。开发快速检测诊断将有助于改善结核病控制。此外,在COVID-19大流行期间,基于CRISPR的SARS-CoV-2检测技术的迅速开发,推动了这项技术应用于即时检测和自我检测的发展。比如CRISPR集成微流控设备[5]或者纸基分析设备[6]因为价格相对便宜、便携、一次性等特点使其具有在资源匮乏环境应用的潜力以及在资源有限的条件下进行大规模筛查。此外,针对其他传染病(如乙型肝炎病毒、猴痘病毒等)以及癌症相关标志物(如HPV、EBV、miRNA等)开发的CRISPR检测方法也有较好的检测性能。当采用电化学方法进行信号读出时,改进金电极元件和CRISPR集成传感器能降低检测成本,比如一种环介导等温扩增技术(LAMP)联合CRISPR HPV检测方法能够把每个检测的成本降至2.3美元同时维持了较高的敏感性(104copy/test)[7]。在CRISPR-Dx设计环节通过智能计算筛选病毒及其亚型的靶标核酸序列能有效提高全面、精准、快速检测病毒的目的[8]。但是目前这些检测方法仍然需要进一步进行临床验证研究。


尽管CRISPR技术在即时检测中展现出良好的应用前景,但要广泛应用于资源匮乏地区仍面临诸多挑战,例如,如何在无冷链运输和储存的条件下保持试剂稳定;在保证检测效果的同时降低成本,检测设备昂贵或不便携,限制了其在低资源环境中的应用;样本处理与检测流程复杂,需要专业人员操作则难以普及。随着技术的不断进步和创新,这些挑战有望逐步得到解决。


综上,CRISPR技术为即时检验和自检技术带来新的突破将助力资源匮乏环境中检测能力的提升。未来的CRISPR-Dx将更加便携、易用、准确且经济,将对全球范围内的医疗保健产生深远影响。


原文链接:https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/lc/d4lc00340c

参考文献


1.Qian X, Xu Q, Lyon CJ, Hu TY. CRISPR for companion diagnostics in low-resource settings. Lab Chip. 2024 Oct 9;24(20):4717-4740. doi: 10.1039/d4lc00340c.
2.Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017 Apr 28;356(6336):438-442. doi: 10.1126/science.aam9321.
3.Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27;360(6387):436-439. doi: 10.1126/science.aar6245.   
4.World Health Organization. Global tuberculosis report 2024. https://www.who.int/publications/i/item/9789240101531. Accessed on 2024.11.05.
5.Chen FE, Lee PW, Trick AY, et al. Point-of-care CRISPR-Cas-assisted SARS-CoV-2 detection in an automated and portable droplet magnetofluidic device. Biosens Bioelectron. 2021 Oct 15;190:113390. doi: 10.1016/j.bios.2021.113390.
6.Sritong N, Sala de Medeiros M, Basing LA, Linnes JC. Promise and perils of paper-based point-of-care nucleic acid detection for endemic and pandemic pathogens. Lab Chip. 2023 Mar 1;23(5):888-912. doi: 10.1039/d2lc00554a.
7.Zamani M, Klapperich CM, Furst AL. Recent advances in gold electrode fabrication for low-resource setting biosensing. Lab Chip. 2023 Mar 1;23(5):1410-1419. doi: 10.1039/d2lc00552b.
8.Metsky HC, Welch NL, Pillai PP, et al. Designing sensitive viral diagnostics with machine learning. Nat Biotechnol. 2022 Jul;40(7):1123-1131. doi: 10.1038/s41587-022-01213-5.     


编译:Qian Xu

对:Evan Flle

排版:花城诚成

封面来源:Freepik


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