Nature┃蛋白质芯片揭示多发性硬化症的体液免疫新机制

文摘科学 2024-07-28 21:24 北京

研究背景

在脑脊液（CSF）中存在寡克隆带（OCBs， oligoclonal bands），同时去除B细胞对多发性硬化症（MS）治疗的有效性，证明了B细胞在多发性硬化症病理中有着重要性。多发性硬化症患者通常存在腮腺炎病毒、麻疹病毒、水痘-带状疱疹病毒（VZV）和EB病毒（EBV, Epstein–Barr virus）的抗体，但相关性尚不清楚。在多发性硬化症患者中，几乎所有人在临床症状发展之前可以检测到抗EBNA1抗体，这为多发性硬化症与EB病毒之间的流行病学联系提供了证据。在EBV感染期间单核细胞增多增加了患多发性硬化症的风险。病毒和自身抗原之间的分子模仿可能是解释这种关联的潜在机制。

2022年1月24日，斯坦福William H. Robinson教授团队在Nature（IF：50.5）杂志上发表题为“Clonally expanded B cells in multiple sclerosis bind EBV EBNA1 and GlialCAM”的研究论文，作者展示了EB病毒转录因子EBV核抗原1（EBNA1）与中枢神经系统蛋白质胶质细胞粘附分子（GlialCAM）之间的高亲和性分子拟态，并提供了其相关性的结构和体内功能实验证据。

主要成果

● 揭示了多发性硬化症患者脑脊液中B细胞特征图谱；

● 基于蛋白质微阵列检测针对MS相关病毒的重组表达的CSF来源的抗体，初步鉴定出一种交叉反应性抗体；

● 序列分析、亲和力测量以及与Fab片段复合体中的EBNA1-肽表位的晶体结构，追踪从未经训练的EBNA1限定抗体到成熟的EBNA1-GlialCAM跨反应抗体的发展过程。

研究结果

多发性硬化患者的脑脊液B细胞库

从疾病发作（临床孤立综合征，n = 5）或急性发病期间（n = 4）获得CSF和血液样本。选择了脑脊液中白细胞浓度 >10个细胞/μl的患者。作者通过流式细胞术从血液中分选浆母细胞（PB）和匹配CSF样本中的B细胞，并对它们的全长配对重链（HC）和轻链（LC）VDJ区域进行了测序。共鉴定来自血液PB的13578个配对序列和来自CSF B细胞的1689个序列。CSF库高度克隆（图1a），表明在CSF中发生选择性克隆的抗原特异性增殖。值得注意的是，没有多发性硬化但存在神经炎症情况的三个个体的未表现出广泛的克隆性（图1a，b）。虽然免疫球蛋白HC-V（IGHV）和LC-V（IGLV）基因的体细胞高度突变（SHM）量在血液和CSF中的PB之间没有差异，但CSF PB中HC互补决定区3（CDR3）的长度比血液中长。CSF中的B细胞库偏向于使用五个IGHV基因（图1c），这表明特异的自身抗原驱动PB在CSF中的存活和增殖。多发性硬化症患者脑脊液中的免疫球蛋白水平升高，少数高度丰富的OCBs的存在是该疾病的标志。为了确定克隆性PBs是否是鞘内免疫球蛋白的来源，作者从CSF中分离出免疫球蛋白，通过质谱法对其进行表征，并将谱图与其相应的抗体库序列数据集进行比较。对于87%的克隆序列，鉴定出与患者特有的可变链序列匹配的肽，而这种情况发生在40%的单例序列中（图1d）。结果表明，克隆扩增的PBs是CSF OCBs的主要来源。

图1 MS血液和CSF中的B细胞库

脑脊液的B细胞编码抗体与EBV结合

来自MS脑脊液的148个B细胞受体（BCR）序列，每个代表一个克隆，表达为单克隆抗体（mAbs）。为了检测抗病毒反应性，作者使用EBV病毒蛋白质微阵列进行检测：包含2种EBV病毒裂解产物、23种潜伏和溶解蛋白质、240个覆盖四种EBV蛋白的肽段以及其他7种与MS相关病毒蛋白（图2a、b）。表达的mAbs中约三分之一与EBV蛋白质和肽段结合，约20%与其他病毒结合，特别是与水痘和巨细胞病毒（CMV）结合（图2a）。一半的水痘反应性抗体对巨细胞病毒和EBV具有交叉反应，这表明在疱疹病毒中存在保守的抗原表位。

作者还发现，来自九名MS患者中的六个mAbs与EBV转录因子EBNA1结合（图2a），并且在九名患者样本中，发现了结合EBNA1肽段的mAbs（图2b）。

图2 MS-CSF B细胞mAb对EBV蛋白的反应性以及MS39p2w174与EBNA1AA386–405的相互作用

抗EBNA1反应与MS流行病学有关，并且氨基酸区域AA365–425是MS患者反应的靶标。蛋白芯片结果显示，mAb MS39p2w174与AA386–405的EBNA1中结合（图2b）。通过使用全长和截短的EBNA1蛋白质进行的Western blot分析（图2c）和基于ELISA的EBNA1肽段检测（图2d）证实了这一表位。肽芯片果显示Pro/Arg丰富区域AA394–399是MS39p2w174结合的中心表位（图2e）。

EBNA1-CSF Fab复合物的结构

针对更广泛的EBNA1区域AA365–425的抗体存在于MS患者中，但它们的相关性仍然不明确。作者解析了EBNA1AA386–405与MS39p2w174的Fab区域的晶体结构，分辨率为2.5 Å（蛋白数据银行PDB：7K7R）（图2f–j）。观察到EBNA1残基P394–P398与除LC-CDR2外的所有CDR区域的密切相互作用。LC-CDR1的残基Tyr31和Tyr38与HC-CDR1的Trp38以及HC-CDR3的Pro108、Pro109和Tyr114共同形成一个疏水笼，包裹着肽段的两个N端脯氨酸残基Pro394和Pro395，以及Arg396的近端侧链（图2h，i）。抗体结合槽的C端较宽，Pro398由一个大的芳香色氨酸残基（HC-CDR1中的Trp114）支撑（图2g，h）。肽段的中心精氨酸残基Arg395和Arg396与HC-CDR2、HC-CDR3以及HC框架区域2形成氢键。

MS39p2w174的IGHV编码基因是IGHV3-7，这是CSF中过度表达的IGHV链之一（图1c）。值得注意的是，与EBNA1直接相互作用的残基除了两个外，其余均为未突变的生发基残基。作者假设MS39p2w174的未突变祖先（生发基）可能具有固有的结合EBNA1AA386–405的倾向。与MS39p2w174相比，生发基具有更高的多反应性，生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry）显示生发基与EBNA1的结合亲和力几乎与MS39p2w174相同MS39p2w174的解离常数（Kd）为1.99 ± 0.63 nM，而生发基为4.19 ± 0.76 nM（图2k，l），这表明SHM对于有效的EBNA1结合并非必需，而天然B细胞具有EBNA1特异性。

EBNA1与GlialCAM的分子模拟

接着作者在HuProt微阵列上检测mAb MS39p2w174，该阵列涵盖超过16,000种蛋白质，覆盖了人类蛋白质组的80%以上， MS39p2w174与GlialCAM结合（图3a）。GlialCAM是免疫球蛋白超家族细胞粘附分子，在中枢神经系统（CNS）中由星形胶质细胞和少突胶质细胞表达。作者实验室早期对MS脑损伤进行的蛋白质组学研究显示，GlialCAM在慢性活动性斑块中表达。作者还使用了人类蛋白组的噬菌体展示免疫沉淀和测序（PhIP–seq）检测MS39p2w174。MS39p2w174未表现出对任何单一肽段的高富集性，这表明它对多个天然肽段的亲和力较低。肽段结构分析确定了一个常见的富含Pro/Arg的结构模式，与EBNA1的中心抗原表位（AA395–399；图2e）非常相似。将PhIP–seq结果与HuProt结果进行比较，得到了两个重叠的靶标：广泛表达的与肌动蛋白丝相关蛋白1（AFAP1）和中枢神经系统蛋白GlialCAM。通过ELISA（图3b）和Western blotting（图3c），确认MS39p2w174与GlialCAM的胞内结构域（ICD；AA262–416）结合。MS39p2w174在小鼠大脑中显示出明显的胶质染色，包括小脑中的星形胶质、胶质限制带以及海马和脑干中的血管周围胶质细胞（图3d）。尽管作者证明MS39p2w174及其未突变的生发基祖先对EBNA1具有类似的亲和力（图2k，l），它们与GlialCAM的结合亲和力却显著不同。MS39p2w174与GlialCAM的亲和力增加了≥10倍（EBNA1的Kd为1.99 ± 0.63 nM，而GlialCAM为190 ± 17 pM）。相比之下，生发基与GlialCAM的结合亲和力较低（EBNA1的Kd为4.19 ± 0.76 nM，而GlialCAM为10.46 ± 4.12 nM）（图3e，f）。尽管生发基倾向于与EBNA1结合，MS39p2w174的SHM使其亲和力提高了一个数量级，以模拟CNS中的GlialCAM。

图3 | EBNA1和GlialCAM之间的分子模拟

GlialCAM的磷酸化促进分子模拟

EBNA1表位AA386–405位于该蛋白质长N末端富含甘/丙富集的区域（AA90–380）与其高度结构化的DNA结合结构域（AA461–607）之间。通过噬菌体展示确定的GlialCAM区域AA337–385，位于ICD的C末端，并包含一个富含脯氨酸的区域，类似于EBNA1的中央表位（图3g）。MS39p2w174在变性条件下与这两种蛋白质反应（图2c、3c），这表明这两个抗体结合区域是线性表位。这一结果与这两个表位都位于各自蛋白质的本征无序区域（图3h、i）的预测一致。MS39p2w174与EBNA1蛋白质和EBNA1AA386–405肽的结合亲和力相似。其差异可能是由于GlialCAM的多聚化造成的。此外，GlialCAM的ICD部分存在高峰度的磷酸化，翻译后修饰（PTMs）通常决定抗体-抗原相互作用。作者确定了围绕中央表位区域的四个丝氨酸残基（Ser376、Ser377、Ser383和Ser384）中的一个的磷酸化能增强MS39p2w174对GlialCAMAA370–389的结合亲和力。事实上，Ser376（pSer376）的磷酸化增强了约50倍MS39p2w174的结合（天然肽的Kd为302 ± 0.078 nM，pSer376肽的Kd为6.1 ± 0.27 nM），进一步磷酸化Ser377进一步增强了结合亲和力（pSer376/pSer377肽的Kd为3.73 ± 0.15 nM）（图3j–l）。EBNA1AA386–405中的重要残基Arg397，与HC-CDR2的Glu64形成两个氢键（图2h、j），在GlialCAMAA370–389中被丙氨酸（Ala381）所取代（图3g）。这可能解释了EBNA1和GlialCAM肽的不同结合亲和力。Ser376的磷酸化可能通过提供新的极性相互作用增强结合，可能与HC-CDR2中的Arg36有关，这是一种带正电的残基，从生殖细胞中突变为天冬酰胺（图2h）。综上所述，作者的结果表明，翻译后的磷酸化使得抗EBNA1的MS39p2w174与GlialCAM发生交叉反应。

在MS中抗GlialCAM IgG的反应分析

为了确定MS39p2w174抗GlialCAM的观察到的反应性是否代表了MS中更广泛的现象，作者对其余的147个单克隆MS mAbs进行了检测，以检测它们对GlialCAM蛋白和跨越GlialCAMAA315–395的肽段的反应性。来自七名患者的另外十个mAbs结合了ICD，而来自四名患者的七个mAbs结合了细胞外结构域（ECD）（图3m），这表明MS外周血浆细胞产生了针对多个GlialCAM表位的抗体。

接下来，作者测试了MS患者（n = 36）和非患者（n = 20）的血浆样本对EBNA1和GlialCAM的反应性。如预期，所有来自MS患者的样本和大多数来自健康个体的样本都展示了对EBNA1蛋白的血浆反应性（图3n）。在MS患者中，对EBNA1AA386–405和GlialCAM的反应性显著增加（图3o, p）。接下来，作者验证了是否可以通过GlialCAM来阻断对EBNA1AA386–405的反应性。在九个高反应性样本中观察到了通过GlialCAMAA370–389 pSer376来抑制抗EBNA1AA386–405反应性的结果（图3q），这表明在MS患者中存在这种分子拟态的普遍性。

EVNA1免疫加重EVE

为评估抗EBNA1AA386–405免疫反应对神经炎症的影响，作者使用了自身免疫脑脊髓炎（EAE）小鼠模型，这是模拟多发性硬化症的小鼠模型。作者对SJL/J小鼠进行了免疫，分别使用乱序对照肽或EBNA1AA386–405。三周后，通过第二次免疫，使用与蛋白脂质蛋白（PLPAA139–151）混合的相应肽段诱导EAE。针对EBNA1AA386–405（图4a）和GlialCAM ICD（图4b），EBNA1AA386–405组的小鼠产生了强烈的抗体反应。EBNA1处理组表现出更严重的部分瘫痪（图4c），并伴有增强的中枢神经系统免疫细胞浸润（图4d, e）。在CD8⁺T细胞中，高表达的IFNγ和粒酶B表明在两组中均有强烈的CD8+ T细胞反应EBNA1，而只有来自多发性硬化症患者的CD8⁺T细胞对GlialCAM ICD和GlialCAM ECD有反应（图4f）。

结果表明，在EBNA1AA386–405免疫后产生了抗GlialCAM抗体。此外EBNA1AA386–405和PLPAA139–151免疫小鼠加剧了中枢神经系统免疫细胞浸润和脱髓鞘化，这是人类多发性硬化症病理学的两个显著特征。除了抗GlialCAM抗体水平外，作者的人类T细胞数据表明CD8⁺T细胞在免疫反应中对GlialCAM起着重要作用。

图4 抗-EBNA1AA386–405免疫加剧自身免疫介导的体内脱髓鞘

总结

长期以来，多发性硬化症和其他自身免疫性疾病的病毒触发因素一直是需要深入研究的问题，但有证据表明它们发挥了作用相关性不足。通过利用成对BCR库测序、克隆抗体序列的合理选择和三个独立的高通量蛋白质组学平台，作者从一名多发性硬化症患者的脑脊液中鉴定出一种mAb，该mAb以高亲和力结合表位EBNA1AA386–405，并与GlialCAM发生交叉反应。作者证明了在20-25%的MS患者中存在EBV EBNA1和GlialCAM交叉反应性抗体，并表明用该EBNA1表位免疫EAE小鼠会加剧自身免疫性脱髓鞘。作者的发现证明了EB病毒感染与多发性硬化症的病理生物学之间的机制联系。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-022-04432-7

参考文献

Lanz, Tobias V et al. “Clonally expanded B cells in multiple sclerosis bind EBV EBNA1 and GlialCAM.” Nature vol. 603,7900 (2022): 321-327. doi:10.1038/s41586-022-04432-7

编译：Crystal

校对：Evan Flle

排版：花城诚成

封面来源：Freepik

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