微塑料或成脱发新“元凶”！｜EI：老化的聚苯乙烯微塑料通过氧化应激途径加剧与紧密连接损伤和细胞凋亡相关的脱发

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• 初步探索MPs和老化MPs对皮肤组织和毛囊影响；
  

• MPs和老化MPs引起的大量ROS积累，加剧了皮肤氧化应激、细胞凋亡，导致脱发；

• 老化MPs通过ROS介导的线粒体途径促进细胞凋亡。

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       近年来，全球塑料产量显著且持续增长，2019年达到了3.7亿吨。微塑料污染对人类和动物的健康构成了巨大风险，是全球关注的一个环境问题。聚苯乙烯微塑料（Microplastics，MPs）的尺寸为0.1到5000微米，在海洋环境中普遍存在。微塑料可以悬浮在水体中，被多种水生动物摄取，而这些动物最终被人类食用。对人类细胞体外研究，以及对啮齿动物和水生生物的研究已经表明，小于10微米的MPs可以从胃肠道转移到淋巴和循环系统，从而导致MPs在许多器官中广泛暴露和积累，如肝脏、肾脏和大脑。

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• 通过多种技术分析了和比较了MPs和老化MPs的形态、元素组成和表面官能团；

• 探索原始MPs和老化MPs对皮肤组织的毒性和潜在机制，特别是氧化应激、细胞凋亡、紧密连接（tight junction，TJs）损伤和脱发之间的相互作用。

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       MPs在原始溶液中的密度为1.064克/立方厘米，尺寸约为120纳米，老化的微塑料是通过将原始MPs放置在带有石英盖的500毫升石英玻璃瓶中，然后用氙灯（波长200-800纳米；550瓦/平方米）模拟阳光照射6周来生成的。随后，老化的MPs被放置在玻璃容器中，并在37摄氏度的真空干燥设备中干燥48小时，然后进行分析。

       使用多种技术对MPs和老化MPs的形态、元素组成和表面官能团进行了分析。这些技术包括扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）。使用ImageJ软件评估了TEM图像的尺寸分布；使用纳米粒度分析仪（Nano-Zetasizer 1000 S）测量了MPs和老化MPs的zeta电位。使用光学接触角测量设备（OCA20）确定了MPs和老化MPs的接触角。在196摄氏度下获得的氮吸附/脱附数据（SSA-4300）用于确定MPs和老化MPs的比表面积。使用IVIS Lumina成像系统来识别MPs和老化MPs中ROS的积累。使用扫描透射电子显微镜（STEM）结合能量色散X射线光谱（EDX）确定了MPs和老化MPs的表面元素组成。

       HaCaT和L929细胞在含有10%（v/v）胎牛血清的DMEM中培养。然后将它们放置在37摄氏度的CO2培养箱中。使用FITC标记的MPs来观察L929和HaCaT细胞对MPs和老化MPs的吸收和积累。细胞用FITC-MPs和FITC老化MPs（25微克/毫升）处理一定粒径24小时。为了确定微塑料毒性中涉及的氧化应激，细胞用Tempol（一种模拟超氧化物歧化酶的ROS清除剂）处理，然后加入到细胞培养基中。对于Tempol/MPs和Tempol/老化MPs共处理组，细胞系与3毫摩尔/升Tempol和25微克/毫升MPs/老化MPs共培养24小时，然后收集细胞进行后续测试。

        四周大的C57BL/6小鼠（25只雄性和25只雌性），被安置在SPF级动物设施中。雄性和雌性小鼠被随机分配到不同的组别并分开饲养。小鼠被安置在22摄氏度±2摄氏度，空气湿度为50%±5%，12小时明暗循环的环境中，并且提供充足的食物和水。中山大学动物护理委员会批准了所有的动物实验程序（批准号0064257）。所有动物试验均遵守ARRIVE指南，并根据欧盟指令2010/63/EU进行动物试验。经过1周的适应期后，小鼠通过口服灌胃给予有无MPs/老化MPs的双重蒸馏水（ddH2O），并随机分配到不同的组别，分组如下：对照组（100微升ddH2O），MPs组（30毫克/千克），老化MPs组（30毫克/千克）。对于与MPs+Tempol或老化MPs+Tempol共处理的试验组，在暴露于MPs或老化MPs前7天开始，每日腹腔注射Tempol（15毫克/千克）。最后使用二氧化碳对小鼠进行安乐死，并收集样本进行后续分析。 

      小鼠皮肤组织被迅速冷冻，并在最佳的切片温度下切成10微米厚的切片，然后安装在玻片上。根据制造商的协议，使用DHE-ROS检测试剂盒（BestBio）来确定皮肤组织ROS的产生。使用DCFH-DA检测试剂盒（Solarbio）测量HaCaT细胞中ROS的产生。使用共聚焦显微镜（Zeiss LSM880）分析染料发出的荧光。使用连续的商业检测试剂盒（Solarbio）根据制造商的说明，使用皮肤组织来研究与氧化应激相关的标记物，如过氧化氢（H2O2）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、ROS和谷胱甘肽（GSH）。 

       小鼠在处死之后，所有小鼠的背部皮肤被固定在4%的甲醛（PFA）溶液中过夜，然后嵌入石蜡或OCT（SAKURA）中。石蜡切片厚度为6微米，使用苏木精和伊红（HE）方法染色。8微米厚的冷冻切片随后用于后续的免疫荧光染色。首先，引入了一种由0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、0.1%Triton X-100和0.2%明胶组成的通透化试剂，处理15分钟。然后用10%的正常山羊血清封闭样品1小时。随后，切片在4摄氏度下与一抗孵育过夜。之后用PBS洗涤两次，并加入Alexa偶联的二抗。二抗在37摄氏度的暗处孵育1小时。在加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）处理15分钟之前，切片用PBS洗涤两次，然后使用LSM880共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行检查。

       L929和HaCaT细胞被放置在一个35毫米的玻璃皿中，并让它们生长2天，直到它们覆盖了整个表面。处理后，细胞用PBS冲洗，并用4%的甲醛（PFA）处理15分钟。随后，细胞被置于新的封闭缓冲液中（含0.5%的Triton X-100在PBS中，pH 7.4，含有10%的正常山羊血清），并在37摄氏度下孵育1小时。细胞在4摄氏度下与抗Claudin-1或抗Occludin的一抗培养过夜。经过三次PBS洗涤后，样本暴露于含有3%牛血清白蛋白的PBS中的Alexa Fluor 488（Occludin）和Alexa Fluor 647（Claudin-1）。然后细胞在37摄氏度下孵育1小时。随后，细胞核用DAPI染色。接着使用Zeiss CLSM获取图像。

       关于体内追踪MPs和老化MPs，将Cy7标记的MPs和老化MPs通过口服灌胃给小鼠，然后取背部皮肤进行冷冻切片。组织切片用DAPI染色，然后使用CLSM观察MPs和老化MPs在皮肤和毛囊细胞中的荧光分布。    

       皮肤组织和细胞系使用RIPA裂解缓冲液进行裂解，用于蛋白质印迹分析。蛋白质印迹分析使用了标准技术。信号通过ChemiDoc XRS化学发光系统（Bio-Rad Inc.）进行评估，然后对β-微管蛋白进行归一化。

       皮肤组织样本和HaCaT细胞被浸泡在2.5%的戊二醛溶液中，并在4摄氏度下保存6小时以确保固定。使用磷酸酸洗溶液进行三次冲洗，然后将标本用1%的锇酸固定剂固定2-3小时，然后转移到4摄氏度的环境中保存。接着进行脱水、干燥、包埋，最后使用Leica EMUC7超薄切片机将标本切成50-70纳米的薄片。样本用含有3%铀醋酸和柠檬酸铅的溶液进行双重染色。随后，使用透射电子显微镜（TEM）对标本进行分析和成像。

       每组小鼠的皮肤组织在4摄氏度下用2.5%的戊二醛固定液固定过夜。在PBS中浸泡后，使用一系列酒精浓度梯度（30%，50%，70%，80%，90%，95%和100%）对皮肤样本脱水。皮肤组织经冷冻干燥后真空喷雾。组织被固定在样品支架上，并使用溅射涂覆工艺镀金。皮肤组织被放置在SEM中进行成像。

       采用角质层状况分级系统对毛发表面损伤程度进行分级：0级为角质层边缘隆起；1级为角质层不均匀覆盖，无裂纹或孔洞；2级为角质层明显隆起，有裂纹或孔洞；3级为皮层细胞暴露，4级为角质层完全去除。

       凋亡细胞通过Annexin V和碘化丙啶（PI）检测试剂盒来确定。使用Invitrogen的2′-7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）氧化还原探针来测量ROS水平。简而言之，皮肤组织样本和HaCaT细胞用胰蛋白酶消化以获得单个细胞悬浮液。使用流式细胞仪测量细胞凋亡和细胞内ROS水平。

        图表显示了每组数据的平均值 ± 标准差，每个组别至少有三个生物学重复。统计分析使用双向方差分析和新复极差法进行。在分析之前，使用Shapiro-Wilk检验评估所有变量的正态性，并使用Levene检验评估同质性。通过计算数据（x）的反正弦平方根（arcsin √x）来转换数据百分比。显著性水平设定为p < 0.05。符号ns、*、**、***和****分别表示无显著性、p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001和p < 0.0001。

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‍        经过紫外线照射后，MPs和老化MPs颗粒大小相对均匀（图1A, B）。MPs和老化MPs的平均直径分别为120.10±4.13纳米和116.21±5.72纳米，这表明紫外线老化对MPs的尺寸没有影响。然而，根据SEM观察，MPs和老化MPs在表面特征上表现出明显的差异；MPs的表面平滑且呈球形；而老化MPs出现了皱纹和裂纹（图1C）。与MPs相比，老化MPs的比表面积显著增加（图1F，G），提示紫外线照射可以通过增加粗糙程度和含氧基团来改变MPs的表面性质，最终影响其吸附能力。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了老化MPs的化学老化特性，结果表明，老化MPs中的含氧官能团峰值最大，与原始MPs相比变化最为显著。经过6周的老化后，发现了C-O、酚羟基（C-OH）和羰基（C=O）的伸缩振动（图1E）；这表明老化后含氧官能团的峰强度增加。STEM分析一致显示O元素在碳颗粒中分布均匀，表明O元素在老化MPs的表面富集。

        通常，含氧官能团和O/C比值显著改变了MPs的表面亲水性和电荷。经过42天的照射后，实验组的老化MPs（141.69°±2.6°）比对照组（116.93°±1.3°）更小，表明老化MPs具有最高的亲水性水平（图1H）。这些发现与MPs表面电荷的变化一致，表明紫外线照射通过添加含氧官能团和促进颗粒分散并减少表面电荷。含氧官能团数量的增加可归因于紫外线辐射引起的C-H键断裂后，与氧气反应形成过氧自由基（C-O），这些过氧自由基从周围环境中捕获氢原子，从而形成过氧化氢基团（COOH），随后，这些过氧化氢基团分解成其他产物，如C=O、COH和O-C=O。同样，与原始MPs相比，老化MPs的X射线光电子能谱（XPS）光谱显示出显著差异，如在286.3 eV处出现的新峰所示（图1J）。该峰的存在表明MPs的表面化学键被氧化，形成了羧酸型化合物。老化MPs中的活性氧（ROS）水平显著高于原始MPs，表明紫外线照射后ROS的累积（图1L，M）。同样，STEM分析结果显示O元素在碳颗粒中分布均匀，表明O元素在MPs表面富集（图1K）。观察到的结果可能归因于紫外线照射作为电子转移媒介的作用，增加电子转移，促进ROS在老化MPs表面的生成。

        使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）识别了FITC标记的MPs（图1O），并使用荧光MPs研究了MPs在HaCaT和L929细胞中的内吞作用。FITC标记的MPs给药24小时后，发现大量的MPs在细胞中积累，进一步证实了原始和老化MPs都被内吞进入HaCaT和L929细胞（图1O）。此外，试验组的小鼠分别被灌胃Cy7标记的MPs和老化MPs。结果表明，MPs和老化MPs存在于毛囊内，尤其是在毛囊细胞区的细胞中浓度较高（图1N）。此外，通过TEM持续观察到了毛囊内的MPs和老化MPs（图1P）。这些发现揭示了这些摄入的MPs将穿过食道和胃，最终穿过肠道屏障进入循环系统，然后沉积在毛囊组织中。

图1: MPs和老化MPs的形态特征（A-C）；MPs和老化MPs的尺寸分布（D）；FTIR鉴定的MPs和老化MPs的官能团（E）；MPs和老化MPs的表面积（F，G）；MPs和老化MPs的X射线光电子能谱（J）；MPs和老化MPs的原子分辨图（K）；MPs和老化MPs的ROS含量（L，M）；毛囊荧光图像（N）；MPs和衰老MPs在HaCaT和L929细胞中可视化（O）。

        为了确定MPs是否损害皮肤细胞并加速脱发，5周龄的C57BL/6小鼠通过灌胃给予MPs、老化MPs或双重蒸馏水（ddH2O）处理2个月（图2A）。暴露MPs和老化MPs的小鼠表现出弥漫性脱发（图2B）。为了检查MPs和老化MPs对毛发的影响，采集小鼠的皮肤，并在扫描电子显微镜（SEM）下观察毛发。暴露MPs组的小鼠毛发数量减少，外观粗糙，暴露老化MPs组的小鼠更为明显（图2D-E）。SEM结果显示，对照组的毛发表面损伤大多为0级，而暴露于MPs组主要为1级，暴露于老化MPs组达到了2级（图2D）。从三组样本中获得的HE染色切片的组织学检查显示，与对照组相比，试验组小鼠表皮增厚；而MPs组和老化MPs组的小鼠的真皮厚度比对照组薄（图2C）。此外，为了检查暴露于MPs和老化MPs后毛囊的整体结构，切除小鼠皮肤以观察整个毛囊（图2F）。MPs和老化MPs暴露组的小鼠背部的毛发比对照组短，毛囊数量更少。重要的是，老化MPs组小鼠的毛囊数量明显低于MPs的组（图2G），表明老化MPs显著诱导脱发。总的来说，这些结果表明MPs导致小鼠毛发结构损伤和脱发，老化MPs引起的毒性效应更为明显。

图2：小鼠试验操作流程图(A)；对照组和试验组C57BL / 6小鼠背部毛发的变化（B）；皮肤组织HE染色及表皮、真皮厚度(C)；小鼠背部毛发扫描电镜图(D)；相同放大倍数下皮肤毛发数量的扫描电镜统计图(E)；不同处理组毛囊的显微照片(F)；在显微镜下观察毛囊数量统计图（G）。

       少量ROS的存在已被证明对整体健康或细胞有积极影响，但ROS的积累会加速皮肤老化过程和真皮损伤。氧化应激是由于细胞内ROS产生和清除之间的不平衡所导致的。为了确定MPs是否通过氧化应激引起皮肤损伤和脱发，我们使用DCF探针测量了经MPs和老化MPs暴露的小鼠皮肤中的ROS产生。ROS荧光探针结果表明，接受MPs和老化MPs处理的小鼠在毛囊中积累了高水平的ROS，特别是在生发区和真皮乳头（DP）部分，这与对照小鼠的毛囊ROS含量形成了鲜明对比（图3A）。抗氧化的能力对于维持细胞内氧化还原平衡和防范氧化应激造成的伤害至关重要。在本研究中，小鼠皮肤在MPs暴露后的氧化还原系统发生了显著变化，结果显示，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）在内的抗氧化系统活性在微MPs和老化MPs暴露后显著降低（图3B-D）。相反，与对照组相比，MPs和老化MPs组小鼠皮肤中脂质过氧化产物MDA和H2O2的水平提高（图3E-F），表明PS-MPs抑制抗氧化酶表达并诱导ROS过量产生。同样，在分子水平上，蛋白质印迹分析显示，在MPs和老化MPs暴露后，包括CAT、GPX4、SOD1和SOD2在内的抗氧化酶的表达显著下降（图3G）。

        与MPs组相比，老化MPs组更能诱导氧化应激，表现为抗氧化相关蛋白的下降（图3G）、抗氧化酶活性的抑制（图3B-D, F）以及脂质过氧化产物的积累（图3E, F），这表明老化MPs暴露加剧了皮肤组织中的氧化应激。这些结果可以归因于老化MPs表面ROS的过度积累。此外，与对照组相比，应激诱导酶HO-1在MPs组中显著增加（图3G）。总之，这些结果表明MPs暴露会引起皮肤组织的氧化应激，老化MPs组的氧化应激更为严重。可能与老化MPs的物理化学性质有关，包括ROS积累；塑料添加剂、浸出化学物质和其他有机化学物质的释放；以及加剧的毒性效应。

图3：荧光探针DHE 检测小鼠皮肤ROS含量（A）；小鼠皮肤中SOD和CAT、GSH及MDA、H2O2的含量(B ~ F)；抗氧化相关蛋白和应激反应蛋白的Western blot分析(G)；小鼠皮肤组织细胞增殖情况( H)；小鼠皮肤毛囊休止期和早期生长期示意图(I)；凋亡相关蛋白的Western blot分析(J)；皮肤组织细胞的TEM图像（K）。

       毛发生长周期包括：生长期、退行期和休止期。由于毛发脱落和再生的循环过程，毛发数量基本保持不变。毛囊的下部（毛发生发点）在每个毛发周期中不断重塑，毛囊干细胞存在于毛囊的下隆起部位，对各种外部信号高度敏感。氧化应激产生的ROS已被证明在控制细胞生长、分化和凋亡的几个信号传导途径中充当第二信使。在本研究中，MPs和老化MPs导致小鼠皮肤和毛囊的氧化应激，这干扰了毛囊干细胞的自我更新和分化，进一步抑制了毛发生发点细胞的增殖，并延迟了休止期毛囊进入生长期所需的时间（图3H-I）。先前的研究表明氧化应激调节转录程序蛋白，如P53，并使毛囊细胞周期停滞或凋亡，P53通常通过调节Bcl-2家族来发挥作用。因此，我们检查了小鼠暴露于MPs和老化MPs后皮肤组织样本中Bcl-2家族蛋白的水平。蛋白质印迹法和相对蛋白水平显示，接受MPs和老化MPs处理的小鼠中Bax和Bcl-XL的表达升高（图3J）。相比之下，与对照组相比，Bcl-2在微塑料暴露后显著减少，表明MPs暴露诱导皮肤组织凋亡。

       这种凋亡途径可能导致线粒体功能障碍。线粒体活性降低会降低细胞内ATP水平，导致凋亡。TEM发现对照组毛囊细胞的超微结构正常，而暴露于MPs和老化MPs组的小鼠中观察到线粒体嵴的破坏、肿胀和线粒体空泡化（图3K），这意味着这些MPs诱导了毛囊中线粒体的损伤，促凋亡蛋白的表达，包括caspase-9和caspase-3，在暴露于MPs组中显著增强，与Bcl-2家族的抗凋亡蛋白的表达模式一致（图3J）。与MPs组相比，老化MPs组显著抑制了抗凋亡蛋白的表达，并促进了皮肤组织中的促凋亡蛋白和细胞增殖（图3J），表明老化MPs在皮肤组织中表现出严重毒性；最终，导致毛囊细胞发生凋亡，因为毛囊无法进入生长期。

        为了理解MPs和老化MPs暴露后皮肤和毛囊的解剖学变化，通过组织切片染色和超微结构观察分析了毛囊形态。小鼠皮肤切片的HE染色显示，在暴露于MPs和老化MPs后，皮肤表皮、真皮厚度和毛囊结构没有明显变化。但与对照组相比，毛囊隆起部位的细胞之间存在微小间隙（图4A）；此外，超微结构结果清楚地证实了这一现象。TEM更精确地揭示了毛囊细胞之间粘附位点的形态。电子显微镜研究证实，与对照组相比，MPs和老化MPs组的紧密连接（TJs）和桥粒减少了，并且毛囊细胞之间的连接处存在一些小间隙（图4C）。为了证实这些发现，使用蛋白质印迹法分析了皮肤中的TJs蛋白。在皮肤中，表皮细胞之间的连接主要包括TJs和粘附连接，对两者都进行了分析。结果显示，在暴露于MPs和老化MPs后，TJ跨膜蛋白Claudin-1和Occludin的表达水平降低了（图4B-D），TJs斑块蛋白如ZO-1的表达水平也显著降低（图4B, E）。类似地，在暴露于MPs和老化MPs后，粘附连接蛋白β-catenin的表达水平也极为显著地降低了（图4B, F）。

        值得注意的是，与接受MPs处理的小鼠相比，接受老化MPs处理的小鼠中，如Claudin-1、Occludin、ZO-1和β-catenin等JTs相关蛋白的表达被显著抑制，表明老化MPs促进了脱发。结合上述凋亡结果，MPs和老化MPs暴露导致毛囊TJs损伤和细胞凋亡，随后导致毛发脱发；小鼠毛囊的结构形态在组织切片中保持完整，但毛囊细胞的凋亡破坏了毛囊细胞之间的TJs，因此，毛发不能在毛囊中被充分固定，从而加速了脱发。

        这项研究的结果表明，经MPs和老化MPs处理的小鼠中，ROS过量产生，抗氧化能力逐渐下降，氧化应激指标增加。这表明氧化应激在试验组小鼠的皮肤和毛发损伤中起作用。为了进一步证明氧化应激途径导致皮肤细胞凋亡和脱发，用MPs和老化MPs处理的小鼠也用氧化应激清除剂tempol处理（tempol是一种稳定的、可渗透细胞的亚硝酸盐自由基）。与MPs和老化MPs组相比，tempol与MPs或老化MPs共同处理组小鼠体内ROS积累以及H2O2和MDA水平显著降低（图5 A，B， F）。相反，与MPs和老化MPs组相比，tempol处理组小鼠GSH含量和抗氧化酶CAT和SOD的活性显著增加（图5C-E）。此外，tempol共同处理组逆转了抗氧化蛋白（如GPX4、CAT、SOD1和SOD2）表达的下降（图5G）。

        在表型上，与MPs或老化MPs组相比，tempol共同处理组的脱发得到了缓解（图5I）。这些结果通过小鼠皮肤的SEM观察得到了进一步验证，结果显示tempol共同处理组的毛干数量显著多于MPs和老化MPs组（图5K-L）。值得注意的是，在tempol共同处理组中，每个毛囊生长的毛干数量从MPs和老化MPs组的1到2根恢复到2-3根（图5K-L）。这一发现与既往研究一致表明，tempol可以作为人类局部用药，以减少辐射诱导的脱发。与MPs和老化MPs组相比，tempol共同处理组的毛囊细胞之间的TJs以及皮肤基底层和毛发生发点的增殖得到了恢复（图5J, 6A）。此外，在分子水平上，与MPs和老化MPs暴露的皮肤组织中β-catenin、Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达显著受阻，而tempol共同处理组的表达水平显著恢复（图5H）。这些发现表明，MPs和老化MPs暴露通过氧化应激途径损害TJs并诱导毛发脱发。

        暴露于ROS会导致神经细胞凋亡，ROS介导的P53凋亡级联反应在暴露于MPs时被激活。P53诱导细胞周期停滞以促进DNA修复和/或死亡，从而通过激活目标基因抑制具有显著DNA损伤的细胞增殖。P53是调节Bcl-2家族的主要蛋白，激活Bcl-2家族的Bax促凋亡基因并抑制Bcl-2抗凋亡基因。Bcl-2基因家族由20多个蛋白组成，控制内在凋亡途径并在维持细胞生存和死亡之间的平衡中起关键作用。为了探索MPs或老化MPs引起的氧化应激是否通过内在凋亡途径导致皮肤细胞凋亡，进行了皮肤细胞蛋白的WB分析。WB结果显示，MPs和老化MPs显著降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，并显著增加了促凋亡蛋白P53和Bcl-XL以及诱导凋亡蛋白Bax的水平。此外，tempol共同处理缓解了Bcl-2家族途径引起的凋亡（图6C-F）。

        Bcl-2家族通过参与复杂的相互作用来控制程序性细胞死亡，即凋亡，从而决定线粒体外膜的结构完整性。这条途径是由线粒体外膜的渗透性引起的，使细胞色素（Cyt）C从线粒体膜之间的间隙扩散到细胞质中。TEM显示tempol共同处理显著抑制了MPs和老化MPs暴露引起的线粒体肿胀和空泡（图6B）；线粒体中Cyt C的表达减少，而其在细胞质中的表达增加，表明MPs和老化MPs通过线粒体凋亡途径导致皮肤凋亡（图6H, K）。随后，Cyt C促进caspase-9激活的启动，然后激活执行者caspases-3（图6H-J）。Caspases切割细胞底物以诱导凋亡表型（图3K, 6B）。这些结果表明，MPs和老化MPs引起的氧化应激可以触发内在的线粒体凋亡途径，导致皮肤组织凋亡，同时使用自由基清除剂tempol可有效缓解皮肤组织凋亡，进一步证明MPs和老化MPs可以通过线粒体Cyt C途径在氧化应激条件下诱导凋亡。

图5：毛囊和皮肤组织中ROS水平(A)；皮肤和毛囊氧化指标(B-F)；皮肤组织抗氧化酶的蛋白质印迹分析(G)；TJs相关蛋白的Western blot分析(H)；不同处理组小鼠背部毛发的变化(I)；小鼠毛囊横切面HE染色(J)。SEM图像中显示毛干数量的统计图(K)；小鼠带毛皮肤代表性SEM照片(L)。

       角质形成细胞占表皮细胞总数的95%，像HaCaT这样的永生化角质形成细胞系常被用作研究模型系统，因为它们能够提供一致的、可复制的和统一的生物材料。在本研究中，MPs和老化MPs被添加到HaCaT细胞的培养基中，使用DCFH-DA检测细胞中的ROS产生。结果表明，MPs和老化MPs导致HaCaT细胞中ROS积累，而tempol共同处理显著降低了荧光强度（图7A）。这些结果与流式细胞仪分析和荧光强度趋势一致（图7B）。在分子水平上，HaCaT细胞中抗氧化酶（SOD1、SOD2和CAT）的表达水平，与体内实验中MPs和老化MPs对皮肤组织的影响变化一致。在试验组小鼠体内抗氧化酶的表达显著下降，而tempol共同处理组中抗氧化酶下降趋势得到缓解（图8D）。

       随后，为了探索MPs和老化MPs引起的氧化应激是否导致HaCaT细胞凋亡，我们使用Annexin V-FITC和PI染色评估MPs和老化MPs对细胞凋亡的影响。流式细胞仪的结果表明，与对照组相比，试验组的早期凋亡细胞（Annexin V + PI-）数量分别增加了7.68%和9.44%，晚期凋亡细胞（Annexin V + PI +）的数量分别增加了11.21%和16.21%。然而，tempol共同处理组的早期和晚期凋亡细胞的百分比分别大约下降了3%和8%（图7C），表明MPs和老化MPs通过氧化应激途径诱导HaCaT细胞凋亡，与皮肤组织的结果（图6）类似，蛋白质印迹法的结果证明MPs和老化MPs触发了HaCaT细胞的线粒体凋亡途径，这也导致P53增加，调节Bcl-2家族导致Cyt C释放到细胞质中，并最终激活。

       在超微结构上，用MPs和老化MPs处理HaCaT细胞后，TEM揭示了空泡的显著积累和线粒体的增大。在tempol共同处理组中，异常线粒体显著减少（图7D）。这些发现表明，在MPs或老化MPs处理后，HaCaT细胞经历了氧化应激途径介导的凋亡。小鼠毛发干丢失的原因有毛囊隆起细胞之间的粘附减少，因此，我们在MPs或老化MPs处理后测量了HaCaT细胞的TJs，以进一步验证MPs和老化MPs的损伤机制。免疫荧光染色显示，在用微塑料或老化微塑料处理24小时后，Claudin-1和Occludin（Claudin-1和Occludin参与毛囊细胞的增殖和粘附）在细胞膜上的免疫荧光强度降低，这在tempol共同处理后部分恢复到正常水平（图8A-B）。这与我们的体内发现一致，即MPs或老化MPs暴露破坏了细胞间TJs，这是触发脱发的主要因素之一。与这一观察相似，在分子水平上，Claudin-1、Occludin、ZO-1和β-catenin的表达水平在微塑料或老化微塑料处理组中显著降低，而在tempol与MPs或老化MPs共同存在时，表达水平的降低显著缓解（图8C）。

       老化MPs促进了氧化应激、TJs损伤、细胞凋亡、线粒体空泡和肿胀，从而表现出明显的细胞毒性。这些观察进一步证明，与原始MPs相比，老化MPs加剧了细胞毒性。总之，这些数据表明，暴露于MPs或老化Mps通过线粒体Cyt C途径诱导凋亡，并在HaCaT细胞中诱导TJs破坏，两者都涉及氧化应激。

图7：DCFH - DA荧光探针检测HaCaT细胞ROS生成(A)；流式细胞术检测HaCaT细胞内ROS含量(B)；Annexin V-FITC / PI细胞凋亡检测试剂盒流式细胞仪检测HaCaT细胞凋亡(C) ；TEM(红色箭头：线粒体形态正常；蓝色箭头：线粒体肿胀、空泡化)检测HaCaT细胞凋亡参数(D) 。

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图8：Claudin-1和Occludin在HaCaT细胞中的定位(A-B)；HaCaT细胞TJs(C)； HaCaT细胞抗氧化酶蛋白；细胞中凋亡相关蛋白(E)。

研究结论