第一作者:Yun-de Dou，Meng-ge Zhang
通讯作者:Zi-jiang Chen
通讯单位:山东大学妇儿与生殖健康研究院
期刊: Science of The Total Environment
DOl: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2024.174972
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文章亮点
首次揭示了微塑料(MPs)在人工喂养期间对婴儿的生殖风险。 哺乳期婴儿的MPs 暴露剂量会导致小鼠的雌性生殖障碍。 母代小鼠暴露于 MPS 会损害小鼠后代的生殖功能。 MPs 的可遗传生殖毒性在雄性后代中更明显。 MPs 的可遗传生殖毒性可能是由表观遗传修饰诱导的。 图片摘要
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研究背景
塑料由于其成本效益、稳定的化学性能和出色的电绝缘能力，在人类生活的各个方面发挥着重要作用。塑料用途广泛，但因较高的分解难度和低回收率而产生了巨大的环境污染。
微米级大小的塑料可以轻松进入人体，并且有证据表明微塑料（MPs）存在生物放大作用，可以随着时间的推移通过食物链富集。已有研究表明，通过塑料奶瓶进行人工喂养会释放出大量的MPs，可能对婴儿健康产生不利影响。近年来由于不利环境因素的突出作用，导致不孕率不断上升。此前的研究探究了不同的粒径和浓度的聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）在雌性小鼠中的生殖毒性。
然而，这些研究中的大多数都使用成年小鼠，并且PS-MPs的暴露浓度明显高于实际人类暴露浓度，这与人类暴露于 MPs 的背景不一致。因此，全面评估 PS-MP的实际暴露剂量对女性生殖系统的影响是必要的。
现实中有各种不同的类型塑料聚合物，其中，PS 因其良好的热稳定性和可塑性被认为是最大和最具代表性的环境MPs污染源。这项研究使用 PS-MPs 在 ICR 小鼠中模拟了人类的现实暴露，将母代(F0)雌性小鼠暴露于 PS-MPs 并评估它们从青春期到成年期的生殖表型。通过繁殖子一代(F1)和子二代(F2)，进一步研究了哺乳期间母代小鼠 PS-MPs 暴露对后代生殖健康的影响， 揭示了MPs的代间和跨代生殖毒性。并且通过转录组学分析探索了MPs 生殖毒性的潜在机制。
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研究方法
本次研究使用的是1 μm 荧光 PS-MPs 。将新生雌性ICR小鼠随机分为3组：对照组、MP-high (MP-H)组和MP-low (MH-L)组。分组小鼠从出生到断奶每天通过管饲法给予蒸馏水或精确剂量的 PS-MPs。F1 是由暴露的 F0 雌性成体和野生雄性小鼠交配产生的。F2 是由 F1 雌性小鼠和野生雄性小鼠交配产生的。
根据此前研究，将MP-L 组的暴露剂量定为为每天每 g 体重 2400 个MPs颗粒（每天每 g 体重 1.357 ∗ 10−9g MPs），将MP-H 组的暴露剂量定为每天每 g 体重 2,400,000 个MPs颗粒（每天每 g 体重 1.357 ∗ 10−6 g MPs）。
用红色荧光微球连续灌饲小鼠 21天来研究 PS-MPs 在小鼠性腺中的存在和分布。
小鼠断奶后，每日检查对照组、MP-H 和 MP-L 组 F0 小鼠阴道口打开 （VO）时间和青春期开始时间，并记录肛门生殖器距离 （AGD）。在这期间测量体重。VO 后，每天进行阴道涂片检查，直到检查第一次发情的年龄。对 F1 和 F2 雌性小鼠的青春期生殖表型进行类似的监测。
为了探究PS-MPs 对发情周期性的影响，从 10 周龄开始，每天对雌性小鼠进行阴道涂片细胞学评估，持续 21 天。根据观察到的角化上皮细胞、有核上皮细胞和多形核白细胞的比例，确定发情周期的阶段并将其分类为发情前、发情期和发情期/发情期。
为观察 PS-MPs 对雌性小鼠生育能力的影响，野生型 ICR 雄性小鼠与雌性小鼠以 1：2 的比例配对，持续 3 个月。记录窝数、每窝幼崽数、幼仔总数、出生间隔和配对后天数（从配对到第一窝的天数）。在雄性小鼠的生育力试验中，野生型 ICR 雌性小鼠与雄性小鼠以 2：1 的比例配对，观察到的生育指标与雌性小鼠相同。
研究人员进行了超排卵处理，以测试雌性小鼠的排卵情况。并测量了雌性小鼠的血清性激素浓度。为观察小鼠性腺的形态变化，对卵巢和睾丸进行了组织形态学分析。
研究人员还进行了精子计数、形态学评估和运动学分析。使用 Trizol法提取所有卵巢和睾丸中的RNA，并进行了RNA测序、差异表达基因鉴定和富集分析。
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研究结果
Fig.1 小鼠卵巢切片
PS-MPs对F0小鼠的青春期发育及发情周期的影响
观察到PS-MPs暴露组小鼠的体重有增加趋势，肛门生殖器距离显著增加(Fig.2A)；MP-H暴露组小鼠的阴道开口时间显著延长(Fig.2B)，但并未观测到首次排卵年龄的改变(Fig.2C)。
在哺乳期接触PS-MPs会干扰成年雌性小鼠的发情周期，在MP-H组干扰更为明显。与对照组相比，MP-H组整个发情周期的时间显著缩短（Fig.2D）。此外，MP-H组小鼠在发情期的时间显著减少，而在黄体期的时间显著增加（Fig.2E）。MP-L组小鼠也出现了发情周期的干扰，与对照组小鼠相比，前发情期显著增加，而后发情期显著减少（Fig.2E）。
研究人员进一步探究了关键类固醇合成酶的表达水平，即 Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd3b2、Cyp17a1、Hsd17b1、Hsd17b2、Sult1e1 和 Cyp19a1（Fig.3I）。观察到 Cyp17a1 的表达显著上调，这是一种在雄激素生产中的关键酶。这种升高在 MP-L 组尤为明显，与血清睾酮水平的变化相一致（Fig.3I）。
研究人员评估了卵巢功能相关基因的表达，包括Gdf9、Amh、Bmp15、Amhr2、Bmpr1a、Bmpr1b、Bmpr2、Fshr、Lhcgr、Ar、Esr1、Esr2、Pgr、Insr和Irs1（Fig.3J）。值得注意的是，Amh在MP-H和MP-L组中显著下调。此外，MP-L组中Amhr2、Bmpr2、Ar、Esr2和Insr的表达显著减少，而MP-H组中也有类似的下降趋势，尽管没有统计学意义。
已知MPs具有在多个器官中引发炎症倾向的能力，所以研究人员进一步探究了卵巢中炎症相关基因的mRNA表达水平，包括Il1b、Ifng、Tlr4、P65、Nlrp3和Tnfα。在MP-H组的卵巢中观察到Il1b和Ifng的显著增加，MP-L组中Ifng也有类似的上调趋势。Il1b在MP-L组中也表现出上升趋势。这两个基因表现出明显的剂量依赖效应，提示PS-MPs可能通过介导炎症导致卵巢功能障碍（Fig.3K）。发现卵巢氧化应激相关基因的表达，包括Xdh、Cat、Nrf2、Sod1、Sod2和Gpx1，在各组之间没有观察到统计学显著差异（Fig.3L）。
Fig.3 PS-MPs对F0代雌性小鼠产生了异常的卵巢形态和功能。
母代小鼠在哺乳期间暴露于PS-MPs
对F1和F2雌性后代的生殖功能没有明显影响
母代小鼠在哺乳期接触PS-MPs对F1和F2雌性后代的生殖功能没有明显影响。F1后代是通过野生型雄性小鼠与F0成年雌性小鼠自然交配产生的；F2后代是通过野生型雄性小鼠与F1成年雌性小鼠自然交配产生的。与F0雌性小鼠的实验类似，研究人员系统地观察了F1和F2雌性后代从青春期到成年期的生殖表型。
观察到，F1 MP-H组雌性小鼠在晚期青春期（6至8周龄）体重显著低于对照组（见Fig.S2A）。然而，F2雌性小鼠的体重没有显著差异（Fig.S3A）。
对青春期生殖表型的评估显示，母代小鼠在哺乳期接触PS-MPs对F1和F2雌性小鼠的青春期发育没有明显影响（Fig.4A–C和Fig.5A–C）。成年后，研究人员对发情周期和生育力进行了观察。Fig.4D和Fig.5D分别展示了F1和F2雌性小鼠的典型发情周期。进一步分析（Fig.4E和Fig.5E）显示，F1和F2雌性小鼠的发情周期总次数没有统计学差异。具体来说，F1和F2雌性小鼠在前发情期、发情期、后发情期和间发情期的时间比例也没有显著差异（Fig.4F和Fig.5F）。生育力测试结果表明母代小鼠在哺乳期接触MPs并没有影响F1雌性小鼠（Fig.4G–J，Fig.S2B）和F2雌性小鼠（Fig.5G–J，Fig.S3B）的成年生育力。
随后，探究了F1和F2雌性小鼠在四个月龄时的卵巢形态和血清性激素。发现，尽管F2 MP-H雌性小鼠的卵巢重量有所增加（Fig.5K，Fig.S3C），但母代小鼠在哺乳期间暴露于PS-MPs并未引起F1雌性小鼠（Fig.4K–P，Fig.S2C–D）和F2雌性小鼠（Fig.5L–P，Fig.S3D）的性激素水平、卵巢形态或卵泡发育的异常。总的来说，无论是F1 MP-H雌性小鼠还是F2 MP-H雌性小鼠均未表现出生殖功能障碍，这表明母代小鼠在哺乳期间暴露于PS-MPs所导致的生殖毒性不会在世代之间遗传。
Fig.4 母代小鼠PS-MPs暴露对F1代雌性后代的生殖功能的影响。
Fig.5 母代小鼠PS-MPs暴露对F2代雌性后代的生殖功能影响。
母代小鼠在哺乳期间接触PS-MPs
对F1雄性后代的精子生成产生了不良影响，而F2雄性后代则没有受到影响。
研究人员发现哺乳期间接触PS-MPs并没有导致F1雄性后代的体重变化（Fig.S4A）。然而，它导致了F2雄性后代从青春期晚期到成年期的体重下降（Fig.S5A）。
Fig.6 母代小鼠PS-MPs暴露对F1雄性后代的生殖功能的影响。
Fig.8 F1代雄性小鼠在母代小鼠哺乳期暴露于PS-MPs后的睾丸转录组变化。
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研究结论
研究数据表明，在哺乳期暴露于相当于婴儿配方奶准备过程中从塑料奶瓶中释放出量的PS-MPs，会导致F0代雌性小鼠出现生殖毒性。这种毒性表现为青春期延迟、发情周期紊乱、生育能力下降、睾酮水平升高、卵泡发育异常、卵巢类固醇合成紊乱以及卵巢炎症。并且，雄性后代对母体暴露于PS-MPs引起的代际和跨代生殖毒性更为敏感，表现为精子计数减少、精子存活率下降以及睾丸基因表达谱改变。这些发现有助于更真实和全面地评估与微塑料污染相关的生殖健康风险。
