PBJ | FIND-IT技术: 将系统化的样本池和高灵敏度 ddPCR的基因分型相结合以单核苷酸分辨率靶向鉴定目标性状
学术
科学
2024-07-13 09:31
湖北
在自然界中，遗传变异发生在每个种群中并导致多样性进化。为了加速基于遗传多样性的自然进化，育种家需要诱导额外的突变来增加遗传变异的数量，从而增加获得具有新特性的品种的机会，如提高营养质量、产量和对生物和非生物胁迫因素的适应能力。基于化学诱变剂的诱变被认为是非转基因的，并且已经在大麦（Hordeum vulgare）中使用了几十年。反向遗传技术包括TILLING（靶向诱导局部病变基因组）筛选方法和最近的TILLING-by-sequencing衍生技术，主要用于识别具有价值的基因组改变的植物变异的工具。然而，这些工具目前受到低突变能力的阻碍。![]()
近日，国际知名期刊Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Just FIND-IT: Harnessing the true power of induced mutagenesis”的研究论文，主要介绍了一种名为FIND-IT的技术，这是一种有效的非转基因作物改良方法，主要利用诱导突变技术实现目标性状的精确改良，加速植物的进化过程。TILLING是一种基于PCR的技术，用于检测靶基因中不匹配的单核苷酸。2023年，Szarejko发表了对过去20年TILLING成功案例的全面概述，包括对化学诱变后不同大麦品种和地方品种的TILLING群体的描述(图1a)。TILLING种群大小在1372~9600个单株变异之间。突变频率是单独选择和剂量依赖性的(1/154-1/2500 Kbp)。统计发现大麦TILLING群体中存在的突变总数在1000万到1亿之间(图1a)，但在大麦整个种群中只有不到2%的核苷酸发生突变。这严重降低了在TILLING种群中发现所需突变的可能性。FIND-IT技术于2022年发表在《Science Advances》杂志上(图1b) (Knudsen等人，2022)，提供了一种灵活、高通量的方法来筛选前所未有的大规模化学诱变种群。FIND-IT将系统化的样本池和高灵敏度分裂的液滴数字PCR (ddPCR)的基因分型相结合，以单核苷酸分辨率靶向鉴定所需性状。FIND-IT方法适用于任何可以在田间或培养中生长的生物。实验方法在已发表的文章中有详细的概述，并在图1b中进行了图解。目前总共有超过50万株FIND-IT大麦变种植物可供筛选。FIND-IT技术不仅在大麦中得到了应用，还在其他作物和微生物中得到了应用。目前利用FIND-IT技术已经成功地获得了甜白蜜菜种子、消除了藜麦种子中的抗营养皂苷、改善了大麦谷物中的磷酸盐生物利用度、避免了威士忌生产中的羟基腈葡萄糖苷衍生的致癌物质乙基氨基甲酸酯的形成，并改善了用于工业酿造的酿酒酵母的风味特性。FIND-IT技术的设计基于对大麦使用不同剂量亚硝酸钠进行全基因组测序的结果。研究发现，亚硝酸钠诱变引起的突变均匀分布在大麦的七个染色体上，且在剂量增加时会观察到更多的突变。因此，可以根据不同目的生成FIND-IT文库，用于基因功能分析或大麦育种。与现有的谷物TILLING变异育种资源以及与大麦泛基因组中发现的自然变异相比，育种文库中的FIND-IT脱靶突变压力较低，可以通过回交亲本或在商业育种计划中直接与大麦精英品种杂交来有效降低。在这种情况下，需要注意的是，使用FIND-IT的脱靶突变压力通常会被调整为在具有天然不同基因组的双亲之间的单个经典回交步骤中诱导的SNP数量相当。作为原理对原理的证明，作者通过分离100个大麦基因敲除系和24个具有特定氨基酸替换或miRNA和启动子变体的系，证明了FIND-IT技术方法的效率（图S2）。利用FIND-IT是一种非转基因方法这一事实，数据可以通过在田间种植大麦突变体进行直接验证，这是验证作物新性状的重要要求。目前高质量植物基因组和泛基因组资源的发展使得育种策略变得高度个性化。虽然所选变体的TILLING-by-sequencing资源是静态的，而且CRISPR技术在应用于田间方面仍然面临多重挑战，但FIND-IT方法保持敏捷，提供高灵活性和高通量，并且与育种兼容。FIND-IT文库资源可以定期更新新的优良品系，为特定用途定制（例如冬季与春季作物文库），而ddPCR和样本池的高灵敏度使变异筛选具有高度竞争力。当从具有低个体突变负荷的大型优良品系库中分离出来时，原始的FIND-IT变体可以直接应用于优良育种协议中，从而在产量育种周期中有效地消除脱靶突变，为新性状的市场推广提供前所未有的快捷。 ![]()
图1 FIND-IT技术基础
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14427
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