1. 目标化合物9a-9i和10a-10g的设计与合成
研究者在之前的研究中通过虚拟筛选的策略得到了偶氮氨基嘧啶化合物8f对OfChi-h 表现出高抑制活性(Dong et al., 2022)。通过分子对接研究8f与OfChi-h的作用模式发现8f侧链的苄基苯环可以与OfChi-h的疏水残基形成π-π堆积作用，并且该位置能够容纳较大的疏水片段。为进一步提高偶氮氨基嘧啶类化合物的酶抑制活性及体外杀虫活性，研究者对先导化合物8f进行了两个方面的结构优化，一方面在8f的苄基苯环上引入含氟官能团（化合物9a-9i），拟提升化合物的膜通透性和生物利用度；另一方面，在8f的嘧啶4位引入了大的疏水基团，包括长链烷基和芳香环（10a-10g），拟增强化合物与靶酶的结合亲和力及优化其亲脂性和膜渗透性 (图1)。通过化学合成成功得到了两个系列的偶氮嘧啶类化合物9a-9i和10a-10g。
图1 偶氮氨基嘧啶类化合物的设计及优化策略。
2. 化合物9a-9i和10a-10g对OfChi-h的抑制活性及杀虫活性分析
研究者在1μM浓度下评价了目标化合物9a-9i和10a-10g对靶酶OfChi-h的抑制活性。与8f相比，引入氟原子可明显提高化合物的酶抑制活性。初步构效关系表明化合物苄基苯环上氟取代基的活性顺序为对位>邻位>间位（9b>9c>9a）。随着苯环上吸电子基团数量的增加，抑制活性逐渐降低(9d>9e)。此外，引入强吸电子的-CF3和-OCF3基团会略微降低化合物的抑制活性（9f, 9h<8f），其中引入4-F基团的化合物9b对OfChi-h的抑制活性最高，IC50值为0.1μM (图2a)。
图2 目标化合物的酶抑制活性及杀虫活性
3. 化合物对OfChi-h抑制机制研究
研究者选取代表性抑制剂9b、10a和10g进一步研究了化合物的抑制机理。首先进行了Dixon图分析，如图3a-c所示，化合物与靶酶的作用趋势线均在象限Ⅱ相交，表明化合物9b, 10a和10g是OfChi-h的竞争性抑制剂，其Ki值分别为23.2±1.8 nM，19.4±1.9 nM和43.2±4.5 nM。此外，利用荧光滴定实验确定了10a与OfChi-h之间的结合相互作用。如图3d所示，OfChi-h的荧光强度与化合物呈现浓度依赖，这证实了10a与OfChi-h活性口袋中的色氨酸残基之间存在相互作用。
图3 偶氮嘧啶化合物的抑制机理及作用方式分析
4. 化合物10a和10g对亚洲玉米螟幼虫的影响
研究者进一步研究了具有高OfChi-h抑制活性的化合物10a和10g对亚洲玉米螟幼虫的影响。在预实验中，发现当使用100 μM浓度的10a和10g饲喂亚洲玉米螟幼虫时，大多数幼虫迅速变黑甚至死亡。因此，分别采用4 μM和10 μM浓度的10a和10g对亚洲玉米螟幼虫进行了饲喂实验。使用化合物10a和10g处理亚洲玉米螟幼虫6d后，观察到幼虫的相对体长和体重显著下降（图4a-c）。且幼虫出现卷曲、活动性降低、对外界刺激不敏感等现象，表明偶氮氨基嘧啶类化合物能显著抑制亚洲玉米螟幼虫的生长发育。
5. 化合物10a防治亚洲玉米螟的盆栽试验
研究者根据杀虫活性测定结果选定化合物10a进行盆栽试验。如图4e所示，化合物10a的防治效果优于除虫脲和灭幼脲。50 mg/L浓度的10a喷洒玉米叶片时，第7d对亚洲玉米螟的防治效果达到57%，与100 mg/L的除虫脲和氯虫脲相当。100 mg/L浓度下，第7d对亚洲玉米螟的防治效果为69%，明显高于对照除虫脲和灭幼脲。此外，10a处理玉米叶片7d后，亚洲玉米螟对玉米叶片的取食程度低于对照组。而Tween 80组玉米叶片受损情况非常严重，大部分叶片断裂(图4f)。这也是OfChi-h抑制剂在盆栽试验中对亚洲玉米螟防效的首次报道。这些结果揭示了偶氮氨基嘧啶化合物10a具有开发成为新型、有潜力、作用机制明确的杀虫剂。
图4 化合物10a、10g对亚洲玉米螟幼虫的生长发育影响和化合物10a对亚洲玉米螟的盆栽防治效果
6. 化合物安全性评价
对天敌安全性高是绿色农药的必备标准之一。玉米螟赤眼蜂是亚洲玉米螟的有效天敌，在亚洲玉米螟的生物防治中发挥着重要作用。研究者采用浸卵法和药膜法评价了化合物对玉米螟赤眼蜂的安全性(图5a)。结果表明，化合物9a-9c、10a和10g对玉米螟赤眼蜂的羽化和存活率没有影响，且毒性低于除虫脲。这也显示出几丁质酶Chi-h作为鳞翅目昆虫特有靶标的显著优势。
图5 目标化合物的安全性评价
论文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14538
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