1. 蓝光促进蒲公英中菊苣酸的生物合成
通过对白光(W)、红光(R)和蓝光(B)处理20d 蒲公英的代谢组分析，差异代谢物(DAM)共计812个（图1A）。R_vs_B中差异代谢物最多，且苯丙氨酸合成和代谢途径差异最显著（图1B）。共鉴定到52种酚酸类化合物，其中菊苣酸，咖啡酰酒石酸和奎尼酸在蓝光中显著高于红光（图1C）。转录组分析表明，R_vs_B中共注释到1424个差异表达基因并在蓝光中显著上调，其中苯丙氨酸和黄酮类化合物合成途径关键酶基因共注释到41个成员（图1D）。因此，基于转录组和代谢组联合分析，确定4-香豆素-CoA连接酶（4CL）、查耳酮合酶（CHS）、羟基肉桂酸：奎尼酸羟基肉桂酰基转移酶（HQT）和羟基肉桂酰辅酶A：莽草酸羟基肉桂酰转移酶（HCT）与菊苣酸含量高度相关（图1E、1F）。进一步构建了29个光信号通路蛋白，89个差异表达的TFs和41个多酚类合成酶基因的调控网络（图1G）。TmHY5（bZIP）和TmPIF3（bHLH）与其他成员的连接效率最高。然而，只有TmHY5同时与光信号、TFs和对蓝光有反应的多酚合酶基因相关，这表明它在调节多酚化合物中的潜在作用，值得进一步研究。
图1 代谢组和转录组联合分析表明，TmHY5可能介导了蓝光信号调控蒲公英菊苣酸的合成
2. 改变TmHY5的表达显著影响了菊苣酸、木犀草素和花青素的生物合成
TmHY5是bZIP家族H亚家族成员的核定位转录因子（图2A、2B）。启动子分析及qRT-PCR结果表明TmHY5的表达受蓝光诱导，在花中高表达，且受到ABA、NaCl的正向调控并受到GA的负调控，因此TmHY5参与了蒲公英中的复杂信号网络调控（图2C）。与对照相比，过表达株系中叶柄部分颜色更红（图2D）。同时TmHY5-OE2转基因蒲公英中菊苣酸是对照的1.7倍，OE-1和OE-2中的木犀草素浓度也显著增加（图2E）。基于这些发现，我们假设TmHY5介导蓝光和ABA信号，调节蒲公英多酚生物合成途径中下游代谢物的生物合成。共鉴定了三个CR株系，包括CR#6（双等位基因突变）、CR#9（纯合突变）和CR#19（杂合突变）（图3A）。与对照相比，所有三个TmHY5敲除株系中都表现出显著的表型差异，其生长状态明显较低（图3B）。CR#9株系中菊苣酸浓度最低是对照组的0.50倍；同时，CR#9和CR#19的木犀草素浓度显著降低了0.48倍和0.32倍，且花青素含量也显著降低（图3C）。综合这些结果，我们推测TmHY5基因的过表达和CRISPR-Cas9株系中多酚生物合成途径化合物的积累表现出相反的趋势。
图2 过表达TmHY5促进蒲公英菊苣酸、木犀草素和花青素积累
图3 蒲公英TmHY5敲除株系的鉴定及OE/CR株系的转录组分析
3. TmHY5直接结合TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2的启动子调控菊苣酸的生物合成
在TmHY5-OE2株系中，TmPAL1/3/4、TmC4H1、Tm4CL1和TmHQT2的表达水平显著高于CR#9系（图4A）。因此，TmHY5的过表达导致蒲公英的菊苣酸水平升高。除了受蓝光显著影响的Tm4CL1外，TmHY5的下游靶基因还包括TmPAL1/3/4、TmC4H1和TmHQT2。LUC活性检测表明，TmHY5转录因子显著增强了TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2报告子的表达（图4B）。启动子序列的分析表明，TmHY5结合TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2的启动子上的G-box和AREB motif，导致SD/-Trp/-Leu/+X-gal呈蓝色（图4C）。进一步通过电泳迁移率变化分析（EMSA），使用G-box和AREB motif作为生物素标记探针，检测到DNA-TmHY5蛋白复合物（图4D、4E）。冷竞争探针的存在降低了TmHY5与标记探针的结合。这些结果表明TmHY5与TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2启动子中的G-box和AREB motif结合，参与了菊苣酸及其前体化合物的生物合成。这些结果表明，TmHY5上调了TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2基因的表达进而增强了菊苣酸及其前体的积累。
图4 TmHY5直接结合TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2的启动子调控菊苣酸的生物合成
4. TmCOP1与TmHY5相互作用，蓝光抑制TmCOP1-TmHY5蛋白复合物的降解
TmCOP1蛋白包含三个结构域：RING（氨基酸74-120）、卷曲螺旋（氨基酸53-324）和WD40重复（氨基酸371-575），酵母双杂交结果表明，TmCOP1的WD40重复结构域（371-575）直接与TmHY5相互作用。此外，TmHY5前端氨基酸1-91直接与TmCOP1相互作用，进一步Y2H结果表明TmCOP1和TmHY5的结合位点分别是TmCOP1（371-575）和TmHY5（46-51）（图5A）。LCI和BiFC实验证实了TmCOP1和TmHY5在烟草中的相互作用（图5B、5C）。此外，pull-down实验表明，TmHY5和TmCOP1可以体外互作（图5D）。综上所述，TmCOP1和TmHY5蛋白可以在体内和体外相互作用，结合位点为TmCOP1（371-575）和TmHY5（46-51）。
图5 TmCOP1与TmHY5的相互作用、蓝光抑制TmCOP1-TmHY5蛋白复合物形成
论文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14542
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