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猕猴桃是原产于我国的重要果树，是近百年来驯化最成功的果树之一。猕猴桃果实营养丰富均衡，富含Vc和钾等营养物质，受全球消费者喜爱。我国猕猴桃产量和种植面积占世界总量的50%以上。然而，猕猴桃仍面临诸多产业问题。例如，中华系猕猴桃品种在阳光直射过强过久时，果皮变黑，外果肉偏绿，导致黄肉品种不黄；红肉品种如‘红阳’，在持续高温下，内果肉花青素着色障碍，导致红心品种心不红。近年来，课题组致力于猕猴桃即食控熟与绿色保鲜技术研发，不恰当的采后处理容易导致果心硬化，导致该软不软，降低消费者的消费体验。因此，探究果实组织（如果皮、外果肉、内果肉和果心）发生和衰老的代谢基础非常必要。近日，华中农业大学果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室、国家猕猴桃质量安全与加工保鲜岗位科学家曾云流副教授课题组在《Plant Physiology》发表了题为《Kiwifruit spatiotemporal multiomics networks uncover key tissue-specific regulatory processes throughout the life cycle》的学术论文，揭示了猕猴桃果实发育过程中代谢的组织特性时空变化特征及其分子调控机制。作者系统性地分析了红阳猕猴桃不同果实组织发育特性，确定了影响果实成熟与衰老的五个关键节点。从时间维度上，明确了猕猴桃发育成熟的5个关键点，分别为S1快速生长绿肉阶段 (RG)、S2慢速生长绿肉阶段 (SG)、S3快速生长红肉阶段 (RR)、S4采收成熟度 (HM)，以及S5可食用成熟 (EM；硬度在5-10N)。从组织维度上，果实组织分为果皮、外果肉、内果肉和果心，并以根茎叶花果为对照组织（图1）。![]()
图1 猕猴桃果实组织和发育特性
利用转录组和广泛靶向代谢组技术，对这24个样品进行转录组和代谢组检测。最终得到1,243个代谢物和30,289个表达基因的变化数据库。利用K-means聚类分析，得到分别对应猕猴桃不同组织不同发育成熟时期的10个簇，并筛选到16,206个特异表达基因（图2）。此外，利用WGCNA，将18,299个差异表达基因分成了11个表达模块。结合上述两个数据集，我们创建了一个时空高分辨率猕猴桃时空代谢调控网络Kiwifruit Spatiotemporal Regulatory Networks（KSRN，图2）。![]()
图2. 转录组代谢组K-means分簇结果
利用KSRN，我们成功确认了之前已经报道的决定果心花青素特异积累的关键基因MYB110和MYB10，表明该数据库的可靠性。随后，我们利用KSRN发掘了三个影响猕猴桃果实风味、营养和软化的转录因子及其调控网络。利用KSRN，发现一个ERF转录因子在不同的组织中差异表达。根据系统发育树分析命名其为AcERF1。在内外果肉组织（OP&IP）中，AcERF1的表达量随着发育下降，随成熟上调；果皮和果心组织（Sn&Ce）中，AcERF1在慢速增长（SG&HM）时期高表达，而在两个快速生长时期（RG&RR）低表达。在红阳猕猴桃果实中瞬时过表达AcERF1基因，结果显示AcERF1过表达抑制乙烯产生、抑制果实软化、降低可固含量，表明了AcERF1的表达受果实自身乙烯显著抑制。香气是猕猴桃品质的重要构成。课题组前期研究表明1,8-Cineole（桉叶油醇）在发育过程中显示出组织间的差异积累模式，AcTPS1b是产生香气物质1,8-桉叶油醇的主效基因，赋予猕猴桃果实独特清新的‘薄荷’香味（Zeng et al., 2020），然而AcTPS1b的转录调控途径并不明晰。为了挖掘AcTPS1b潜在的转录调控网络，我们利用KSRN共表达分析筛选到一个AcRAP2.4转录因子。实验表明AcRAP2.4通过直接与AcTPS1b的启动子结合上调AcTPS1b的表达量。同时OE/RNAi果实瞬时转化实验表明AcRAP2.4正调控AcTPS1b表达，诱导1,8-Cineole积累（图3）。![]()
图3. AcRAP2.4上调AcTPS1b表达量来产生1,8-Cineole
猕猴桃素有Vc之王的美称，然而Vc的时空积累模式仍不太清晰。本研究发现 Vc积累具有组织差异，果肉中含量最高。Vc积累具有时期差异，硬果 > 软果。因此，解析Vc时空调控分子机制，有助于选育高营养猕猴桃种质、指导适时食用。为了挖掘Vc生物合成的调控网络，利用KSRN分析发现一个bZIP转录因子与Vc积累丰度高相关（r≥0.8），并与60%以上的L-半乳糖途径关键合成基因共表达（r≥0.8），将其命名为AcbZIP60进行后续实验。结果表明，AcbZIP60直接与Vc生物合成关键限速酶AcGGP3的启动子互作，诱导AcGGP3上调表达，OE/RNAi果实瞬时转化实验表明AcbZIP60正调控AcGGP3表达，诱导Vc显著积累。进一步明确AcbZIP60的功能，我们构建了超量稳定表达植株，与野生型相比，稳定表达植株中：AcbZIP60表达量最高上调5.1倍，GGP3的表达量最高被上调40倍，导致Vc含量最高被上调4.2倍（图4）。综上所述，KSRN数据库是用于挖掘转录调控分子机制有力工具，为猕猴桃代谢的时空变化提供了见解，并为其他水果的代谢调控过程的研究提供了宝贵的资源。![]()
图4. AcbZIP60参与调控猕猴桃抗坏血酸的生物合成
华中农业大学园艺学在读硕士生曾哲彬，博士研究生李亚巍为论文共同第一作者，华中农业大学园艺林学院曾云流副教授为通讯作者，已毕业博士祝曼，硕士王逍遥，硕士王妍等参与了研究。来自果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室邓秀新院士和程运江教授，新西兰植物与食品研究院高级科学家Ross Atkinson, Niels J Nieuwenhuizen、Charles Ampomah-Dwamena和湖北省农业科学院果茶所研究员肖翠等对该研究进行了指导。本研究得到了国家自然科学基金项目面上项目、国家现代农业柑橘产业技术体系、国家重点研发、湖北省重点研发、河南省自然科学基金青年基金、江西省科学院省部级科研项目等项目的资助。曾云流副教授领衔的研究团队长期从事猕猴桃果实品质调控研究，受聘为国家现代（柑橘）农业产业体系猕猴桃质量安全与加工保鲜岗位、湖北省高层次人才计划。针对猕猴桃不可即买即食、商品性较差等问题，阐明了温度、乙烯等贮运条件调控果实质体分化与品质提升的新机制，研发了即食控熟、内外品质综合调控新技术及配套新装备。近年，在 Plant Physiology（3 篇）、Plant Journal（2 篇）等刊物发表高水平论文23篇；主编专著《猕猴桃产业实用技术》1 部；授权植物新品种权 2 项，授权国家发明专利 8 项；研发的 1 项核心技术和 5 套装备，在全国猕猴桃主产省区示范推广，部分成果荣获神农中华农业科技奖一等奖等省部级以上奖励 4 项。
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