细胞计数是指对细胞数量进行定量测定的方法。
在细胞培养实验中，通过细胞计数来确定细胞培养的密度和数量，可以掌握细胞生长的情况。同时，细胞计数也是衡量不同实验条件下细胞生长情况的重要指标之一。
对细胞进行计数定量，可以采用直接计数法，也可以采用间接计数法。以下我们简单介绍，然后将最常用的血球计数板计数法的操作步骤分享给大家。
计数方法分类
第一类方法是直接计数法，利用耗材、设备，配合人工或自动化完成细胞数量的计数。包括：血球计数板计数法、细胞计数仪和流式细胞仪。
其中细胞计数仪的原理又可以分为基于阻抗检测细胞个数，和基于成像分析进行计数，而流式细胞仪是利用散射光对管道内的细胞进行计数。
第二类方法是间接计数法，最常见的有MTT，结晶紫染色、考马斯亮蓝染色法等。他们的原理基本上是依靠染色剂对细胞或细胞核进行染色，然后配合机器读取吸光值变化或人工观察计算细胞核数量来完成计数。
细胞计数的通用方法
接下来，我们分享如何通过血球计数板完成细胞计数。
这个实验的原理是通过胰蛋白酶消化单层细胞，或直接吸取悬浮生长的细胞，然后将细胞加入到血球计数板中，在显微镜下观察并计算细胞个数，最后通过特定公式换算得到细胞的浓度、个数以及密度等指标。
1 以贴壁生长的细胞为例，消化后的细胞充分重悬吹散，取一部分转移至干净的EP管内，例如1mL;
2 使用酒精棉球轻轻擦拭计数板表面和盖玻片，把后者的边缘微微湿润，然后小心盖在计数板的正中间，边缘要能覆盖住计数板上的凹槽；
3 将刚才转移至EP管内的细胞悬液再次进行重复吹打，直到成为单细胞悬液，然后吸20uL悬液出来；
4 将移液器吸头抵在盖玻片的上边缘或下边缘，然后缓缓打出液体，此时液体会因为虹吸作用被吸入盖玻片和计数板之间的空隙内；
5 调整显微镜，使用10倍物镜观察，此时，视野内看到的画面应该如下图所示的中间圆形的红色区域；
6 接下来，要计算图中蓝色区域的25个格子内的细胞总数，这一块区域的总面积是1mm2；
7 计算出总数后，按照下方公式进行计算，得到的结果就是细胞浓度，单位是个/mL
「25个格子内的细胞总数 x 10,000 = 细胞浓度」
8 进一步计算，可以得到细胞总数。
「重悬细胞的培养基体积 x 细胞密度 = 细胞总数」
血球计数板的缺陷和注意事项
血球计数板的使用成本非常低，其整个计数过程因涉及大量的人工操作和计算过程，因此存在较大的误差风险，实验过程中也有很多注意事项。以下分别列举：
细胞悬液的制备：需要将细胞悬液彻底吹散为单细胞悬液，否则大量细胞团块的存在会让细胞计数结果有偏差；
单细胞悬液准备好后，应立即往下操作，而不能等，否则细胞又会慢慢聚集沉降成团；
计数阶段：有的细胞会刚好落在计数板小方格的线上，此时，要遵循数左不数右，数上不数下的原则进行计数；
即左边线上的细胞要计算，但右边线上的则不数，否则将重复计数；
细胞太多或太少：如果数完25个格子，总数在200-500之间（图a），可以继续往下换算；
如低于200，则应该把整个悬液区域一起计数（图b），然后得数乘以1111得到细胞浓度；
如果大于500，则应该重新计数，但只计算25个放个内的单条对角线上的5个格子的总数（图c），然后乘以50,000得到细胞浓度；
如果25个格子的总数小于100，则提示该次结果不准确，应该重新制备细胞悬液再次计数。
细胞成团如何算：成团的细胞算1个，如果视野内存在很多细胞团，建议重新吹散细胞再计数；
如果细胞成团难以吹散或无法吹散，可以尝试用含0.1%结晶紫的柠檬酸于37摄氏度进行细胞裂解1小时，然后计算细胞核总数来代替细胞个数。
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