引言
HPLC 应用最广泛的分离技术。它非常灵敏、特异和精确。
它是柱层析的一种特殊形式,用于生物化学和分析,以分离、鉴定和量化混合物中的活性化合物。 在 HPLC 上有填料(固定相),泵使流动相通过色谱柱,检测器显示分析物的保留时间。 保留时间是可变的,主要取决于固定相、分析物和所用溶剂之间的相互作用。 少量待分析样品被引入流动相流,并通过与固定相的特定化学或物理相互作用而被保留 保留取决于分析物的性质以及固定相和流动相的成分。 高效液相色谱法(HPLC)最常用的溶剂是甲醇和乙腈。
原理
与低压柱液相色谱法相比的优势
与传统的低压柱液相色谱法相比,高效液相色谱法(HPLC)有许多优势。
灵敏度更高(可使用各种检测器) 更高的分辨率 速度更快 便于样品回收(移除的流动相更少) 多种固定相可适用
分支
类型
正相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法
体积排阻高效液相色谱法
离子交换高效液相色谱
生物亲和高效液相色谱
组成
系统的核心是进行分离的色谱柱。
溶剂储液器:玻璃储液器中含有流动相内容物。高效液相色谱法中的流动相或溶剂通常是极性和非极性液体成分的混合物,其各自的浓度根据样品的成分而变化。 泵:泵将流动相从溶剂储液器中吸出,并迫使其通过系统的色谱柱和检测器。根据色谱柱的尺寸、固定相的粒度、流速和流动相的成分等因素,工作压力最高可达 42000 kPa(约 6000 psi)。 样品进样器:进样器可以是单次进样,也可以是自动进样系统。用于高效液相色谱系统的进样器应能在高压(高达 4000 psi)条件下对体积在 0.1-100 mL 范围内的液体样品进行进样,并具有较高的重现性。 色谱柱:色谱柱通常由抛光不锈钢制成,长度在 50 至 300 毫米之间,内径在 2 至 5 毫米之间。色谱柱通常填充粒径为 3-10 微米的固定相。内径小于 2 毫米的色谱柱通常称为微孔色谱柱。理想情况下,流动相和色谱柱的温度在分析过程中应保持恒定。 检测器:高效液相色谱检测器位于色谱柱的末端,在分析物从色谱柱洗脱出来时对其进行检测。常用的检测器有紫外光谱检测器、荧光检测器、质谱检测器和电化学检测器。 数据收集装置:检测器发出的信号可收集到图表记录器或电子积分器上,它们的复杂程度和处理、存储和再处理色谱数据的能力各不相同。计算机将检测器对每种成分的响应进行整合,并将其放入色谱仪中,以便于读取和解释。
应用
制药应用:控制药物稳定性。药物剂型的片剂溶出度研究。药品质量控制 环境应用:检测饮用水中的酚类化合物。污染物的生物监测。 法医学应用:生物样本中的药物定量。鉴定血液、尿液等中的类固醇。纺织品染料的法医分析。测定血液、尿液等中的可卡因和其他滥用药物。 食品和香料:软饮料和水的质量测定。果汁中的糖分分析 蔬菜中多环化合物的分析。防腐剂分析。 在临床检验中的应用:尿液分析、血液中的抗生素分析。肝脏疾病中胆红素和胆绿素的分析。检测脑细胞外液中的内源性神经肽等。
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