茉莉酸 (JA) 是一种调节植物免疫力的重要植物激素。内源 JA 水平由植物中其生物合成和分解代谢的速率决定。当植物遭受病菌侵染时，植物通过JA合成的激活，来增强机体的免疫力。但植物是否也通过抑制JA分解代谢的方式来促进植物对病菌的抗性仍是未解之谜。
2023年12月28日，山东大学生命科学学院刘利静团队在Molecular Plant发表了题为Botrytis
cinerea-induced F-box protein 1 enhances disease resistance by inhibiting
JAO/JOX-mediated jasmonic acid catabolism in Arabidopsis的研究论文。该研究在拟南芥中鉴定了灰霉菌 (Botrytis cinerea) 诱导的 F-box 蛋白 1 (BFP1)。灰霉菌依赖JA 信号诱导 BFP1 的表达，BFP1对 JA 反应和灰霉菌抗性至关重要。BFP1 过表达增强了植物对病原菌的广谱抗病性，且不影响植物的生长。BFP1 与茉莉酸氧化酶 (JAO，也称茉莉酸诱导加氧酶，JOX) 互作并介导其泛素化和降解，这些酶将 JA 羟基化为 12OH-JA。BFP1 影响灰霉菌侵染期间 JA 和 12OH-JA 的积累。此外，JAO2的突变补充了 bfp1 突变体的表型。综上，该研究揭示了植物在病原体侵染后激活免疫反应的一种新机制：抑制 JA 分解代谢。
1 BFP1调节植物对灰霉菌的抗性
灰霉菌在侵染后 24 小时高度诱导了 BFP1 的转录。为了确定 BFP1 如何被灰霉菌上调，分析了起始密码子上游 2 kb 序列，并检测到 4 个 G-box。G-box 是 MYC TFs 的结合位点，负责激活 JA 反应基因。评估了 JAR1、COI1和 MYC2 突变体中 BFP1 的表达水平，它们分别编码 JA-Ile 合成酶、JA 受体和 JA 信号传导中主要的 MYC 蛋白。这些突变体中 BFP1 的上调受到影响，表明灰霉菌侵染后的 BFP1 激活依赖于 JA 信号传导。
为了研究 BFP1 在植物防御灰霉菌中的作用，鉴定出一种转移 DNA (T-DNA) 突变体并将其称为 bfp1-1。用灰霉菌孢子接种 3 周大的 WT 和 bfp1-1 突变体。与 WT 相比，bfp1-1突变体病斑更大，真菌生物量高于 WT。使用 CRISPR-Cas9获得了另一个 bfp1 突变体 bfp1-2。bfp1-2突变体是纯合株系，BFP1 编码区有 1-bp 缺失。灰霉菌接种后病斑明显较大，并且真菌生物量高于 WT。这些结果表明 BFP1 有助于植物对灰霉菌产生抗性。
2 BFP1 对 JA 介导的防御反应至关重要
为了验证BFP1可以调节植物对 JA 的反应，确定了 JA 处理后 BFP1 的表达模式。与 BFP1 响应病原菌侵染表达的结果一致，JA 增加了 BFP1 的转录，并且在 jar1、coi1和 myc2 突变体中 JA 诱导的 BFP1 表达也受到影响。通过两种 JA 标记物植物防御素 1.2 (PDF1.2) 和营养储存蛋白 2 (VSP2) 的表达来确定 BFP1 在 JA 信号传导中的作用。用 100 mM 甲基 JA (MeJA) 处理 12 天的 WT 和 bfp1-1 突变体，这些 JA 标记的诱导在 bfp1-1 突变体中显著减弱，并且 JA 引发的 PDF1.2 和 VSP2 上调在 bfp1-2 突变体中也受到抑制，这意味着 BFP1 是植物对 JA 的完全反应所必需的。
在灰霉菌侵染前 36 小时，向 3 周大的 WT 和 bfp1-1喷洒 MeJA 以激活植物的免疫反应。JA 预处理使灰霉菌引起的病斑在 WT中显著减小，但在 bfp1-1 突变体中几乎没有减小。用丁香假单胞菌 (Psm ES4326) 侵染也取得了相似的结果。然而，JA 一定程度上抑制了 WT 和 bfp1突变体的主根生长。这些数据表明，BFP1 可能在调节 JA 介导的叶片防御反应发挥特定作用，但它不参与 JA 诱导的生长抑制。
3过表达BFP1可增强植物的广谱抗病能力，且不会降低植物的适应性
为了确定BFP1过表达是否会增强植物防御以及是否会影响生长。获得了两个 BFP1 过表达 (BFP1-OX)系，其中 BFP1 表达与 WT 相比增加了约 2000 倍和 5000 倍。与WT相比，BFP1-OX 系中 JA 诱导的 PDF1.2 和 VSP2 水平更高，这证实了 BFP1 是 JA 信号的正调节剂。BFP1的过表达导致灰霉菌侵染后坏死症状减轻、病斑变小、病菌生物量降低。此外，与WT相比，BFP1-OX 系中 Psm ES4326 侵染的病害症状减轻和病菌生物量降低。这些结果表明，BFP1的过表达可以增强植物对病原菌的广谱抗性。
如上所述，BFP1突变对 JA 诱导的根抑制没有显著影响。WT 和BFP1-OX 植株的主根长度在对照和 MeJA 平板上都相当，这表明 BFP1 的过表达不会改变根生长对 JA 的反应。为了确定 BFP1-OX 植物是否表现出任何生长缺陷，仔细观察了 3 周和 8 周大的 WT 和 BFP1-OX 植株的生长表型，发现它们之间的植株大小、重量、高度、花朵或花序没有显著差异。此外，BFP1 的过表达不会影响种子千粒重。为了进一步确定 BFP1 对生长的影响，用灰霉菌和Psm ES4326侵染后BFP1-OX 植株的生长未受到影响。这些结果表明，过表达 BFP1可以实现广谱抗病性，且不会影响植物生长。
4 BFP1 与 JAO 家族蛋白互作
为了探索 BFP1 如何调节 JA 反应，进行了酵母双杂交 (Y2H) 筛选试验。发现了一个截短的蛋白，JAO3 的氨基酸 195-363，包括 2-酮戊二酸 Fe(II) 依赖性加氧酶 (2OG-DD) 结构域。进一步证实了 BFP1 和 JAO3互作。JAO3 是 JAO 蛋白家族的成员，该家族的成员将 JA 羟基化为 12OH-JA，并且所有四种 JAO 都可以在植物中分解 JA。由于 JAO 序列相对保守，且 JAO1 的基础和诱导表达水平与其他 JAO 相比较低，Y2H证明 BFP1可以与JAO2 和 JAO4 互作。这些数据表明 BFP1 可能与 JAO 家族蛋白互作以调节 JA 通路。pull down试验进一步证明了 BFP1-JAO 互作。GST-BFP1 和 HIS-JAO2/3/4融合蛋白分别在大肠杆菌中表达。JAO2/3/4蛋白被 GST-BFP1 下拉，但未被 GST 下拉，这表明 BFP1 直接与 JAO 家族蛋白互作。LUC试验也证明了二者互作。综上，BFP1 可以与 JAO 家族蛋白结合。
5 BFP1 促进 JAOs 的降解
BFP1 是一种正向调节 JA 信号的 F-box 蛋白，而 JAO 是 BFP1 互作蛋白，是 JA 的负向调节剂，BFP1 通过泛素蛋白酶体系统靶向 JAO 进行降解。为了验证这一假设，首先检查了 JAO 是否可以在植物体内泛素化。由于 JAO2 在所有 JAO 中起主要作用，使用该蛋白来代表 JAO。在本氏烟中瞬时表达JAO2-GFP。在样品采集前 12 小时，将 26S 蛋白酶体抑制剂 MG132 渗入同一区域，以防止泛素化蛋白的降解。用抗 GFP 抗体和抗泛素抗体进行免疫沉淀后，在 JAO2-GFP 样本中均检测到了一条大于 JAO2-GFP 预期大小的条带，但在 GFP 对照样本中没有检测到，表明这些条带是 JAO2-GFP 的泛素化形式。
在本氏烟中瞬时共表达 JAO-MYC 蛋白与 BFP1-GFP，与GFP共表达作为对照，以确定 BFP1 是否能够破坏 JAO 的稳定性。当 JAO2/3/4-MYC 蛋白与 BFP1-GFP 共表达时，检测到的 JAO2/3/4-MYC 蛋白较少，而红色荧光蛋白 (RFP) 的蛋白水平不受与 BFP1 共表达的影响。该结果表明 BFP1 促进了 JAO 蛋白的降解。进一步研究了 BFP1 促进的 JAO 降解是否受 26S 蛋白酶体控制，并观察到 MG132 完全阻断了 BFP1 介导的 JAO2 降解。
为了评估 BFP1 是否参与拟南芥中的 JAO 降解，将 JAO2/3/4-MYC 引入由 WT 或 bfp1-1 突变体原生质体中进行了瞬时表达试验。与 WT 原生质体相比，bfp1-1突变体原生质体中所有三种 JAO 蛋白的水平明显更高。此外，JAO2/3/4-MYC 蛋白在 BFP1-OX 原生质体中的稳定性低于WT，这表明拟南芥中 JAO 的积累受 BFP1 调控。此外，将 35S::JAO2-MYC 构建体转化到 WT 和 bfp1-1 突变体背景中。研究了 35S::JAO2-MYC 和 35S::JAO2-MYC/bfp1-1中 JAO2-MYC 随时间的降解情况。bfp1-1突变体中的 JAO2-MYC 蛋白比 WT 中的更耐降解。此外，MG132 抑制了 WT中 JAO2-MYC 的降解，但没有抑制 bfp1-1 突变体中的 JAO2-MYC 降解。由于 BFP1 的表达是由 JA 和灰霉菌诱导的，研究了 JA 或灰霉菌处理是否可以促进 JAO2 的降解。MeJA 处理和灰霉菌侵染后，JAO2-MYC 水平均显著降低，并且这种降低取决于功能性 BFP1 的存在。进一步探索了 JAO 是否能够以 BFP1 依赖的方式在拟南芥中泛素化。在 WT 背景下，MeJA 处理后，JAO2-MYC 蛋白明显泛素化，但在 bfp1 突变体背景下，JAO2-MYC 的泛素化-水平较低。这些数据表明，BFP1 通过泛素-蛋白酶体系统促进 JAO 蛋白的降解。
6 BFP1 调节 JA 和 12OH-JA 的内源水平
由于 JAO 介导 JA 向 12OH-JA 的转化，采用液相色谱-质谱法研究了 2 周大 bfp1-1 和 BFP1-OX 幼苗中的 JA 和 12OH-JA 水平。观察到 bfp1-1 突变体和 WT 幼苗之间的 JA 和 12OH-JA 水平相当。尽管 JA 水平没有受到显著影响，与 WT 幼苗相比，BFP1-OX 系中 12OH-JA 的积累水平较低。为了进一步证明 BFP1 抑制 12OH-JA 的产生，将植物浸没在 MeJA 溶液中，这会增加内源 JA 水平并诱导 WT 植物中 BFP1 和 JAOs 的表达。观察到处理后所有样品中的 JA 和 12OH-JA 水平均显著增加。此外，bfp1-1突变体中的 12OH-JA 水平明显高于 WT 和 BFP1-OX，这表明 BFP1 对抑制 JA 处理后的 JA 分解代谢至关重要。
与 WT 相比，在灰霉菌侵染 24 小时后，bfp1突变体中的 JA 水平明显较低，而 12OH-JA 水平明显较高。此时 BFP1-OX 系中的 JA 和 12OH-JA 水平均低于 WT，这可能是由于该系对灰霉菌侵染的敏感性降低。在侵染后 12 小时，与 WT 中的水平相比，BFP1-OX 系中的 JA 水平较高，而 12OH-JA 水平较低。考虑到有多个基因参与 JA 分解代谢，在灰霉菌侵染后 24 小时研究了这些 JA 分解代谢基因的表达，发现它们的诱导在 bfp1 突变体中受到损害，这与此时 JA 的较低积累相一致。这些结果表明 BFP1 调节 JA 羟基化。
7 JAO2 突变部分挽救了 bfp1 突变体的表型
为了证实 BFP1 依赖 JAO 来调节 JA 介导的防御反应，通过将 jao2 杂交到 bfp1-1 突变体背景中生成了 bfp1 jao2 双突变体。与 bfp1 单突变体相比，bfp1 jao2双突变体显示 JA 诱导的 PDF1.2 和 VSP2 表达部分恢复。接下来，用灰霉菌接种 bfp1 jao2 双突变体，发现在没有 JAO2 的情况下，bfp1突变体中增加的病变大小和病原体生物量被挽救到 WT 水平。这些结果表明 JAO2 在 BFP1 下游发挥作用。消除 JAO2 仅部分挽救了 bfp1 突变体的表型，这表明其他 JAO 也在 bfp1 突变体中积累并促成了 bfp1 表型。
