肽类药物一直是持续不断增长的治疗药物，其分子大小介于小分子药物和生物制剂之间，目前全球市场上已有超过 80 种肽类药物，超过 170 种正在进行临床试验，另有 400-600 种正在进行临床前研究【1】。肽的结构特征使其特别适合抑制蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）与其配体蛋白程序性死亡配体-1（PD-L1）结合，是免疫肿瘤学（IO）中一个已被充分研究的 PPI 通路的一部分。能够抑制这种相互作用的药物可以增强 T 细胞反应，从而改善免疫反应以抵御肿瘤细胞，并在 IO 领域提供相关的治疗益处。针对 PD-1 和 PD-L1 两侧 PPI 的抗体类 IO 药物在晚期临床试验中取得了成功，导致了一种新的治疗范式，并在多种癌症类型中作为标准治疗方法被整合。靶向 PD-1/PD-L1 PPI 的小分子或中分子的药物开发具有重要意义【2】。
最近 Bristol Myers Squibb 研究人员发表的一篇文章讨论了一种 PD-L1 环肽抑制剂的制备规模化。
该药物源自 Peptidream 平台。文章详细介绍了大环肽其独特的结构特征、挑战和工艺解决方案，包括固相肽合成、整体脱保护、线性肽分离和随后的大环化，以实现大规模制造。比较有意思的是文章使用并提到了 RP 与 SFC 的结合来纯化 API，这给环肽纯化提供了额外的思路和可行的案例【3】。
在传统的 SFC 应用中，通常添加酸性添加剂（如三氟乙酸 (TFA)）和碱性添加剂（如二乙胺 (DEA)、三乙胺 (TEA)、异丙胺和氢氧化铵）来分别改善酸性和碱性溶质的峰形。
并且能找到 SFC 应用文章证实添加 TFA 和乙磺酸等阴离子添加剂确实可以成功分析胺、氨基酸和含有碱性侧链的阳离子肽等碱性分析物【4】。
SFC 运行时间更快，由于较低的粘度，平衡时间短，减少溶剂消耗，并在制备后的溶剂去除更为便捷【5】。
Fig. 3. Stationary phase ligands of the three column small peptide screening set: a) 2-ethylpyridine, b) 4-ethylpyridine, c) cross-linked diol (Luna™HILIC.).
Fig. 5. Calculated resolution between example neutral and basic compounds from the library analysis by each of the six SFC screening methods as labeled.
2-EP 作为 SFC 常用的非手性固定相，它本身具有屏蔽硅醇，而 4-EP 和 HILIC 的固定相几何形状增加了氨的影响，从而取代了硅醇与质子化碱的相互作⽤。对于较小、极性较小的大环肽，通常可以使用乙基吡啶（2-EP 或 4-EP）或交联二醇（Luna HILIC）固定相与 TFA 或 TFA 与氨混合来实现出色的分离。对于中型到大型肽，由于 2-EP 性能不佳，简化的方法（仅使用 4-EP 和 HILIC 柱进行筛选）似乎已经足够。两种流动相添加剂通常会对性能产生重大影响，表明肽的电离状态和固定相性质起着重要作用，需要更多固定相研究和改性剂的尝试。
了解 SFC 在多肽纯化上的尝试后，让我们回到 BMS 的文章再来看看他们大环肽的案例【8】。
Fig. 1. Structure of macrocyclic peptide A.
研发人员提供的环肽粗品 HPLC/UV 纯度约为 50%，需要将纯度提高 95% 以上以便后续研究。粗产品中含有过量的 TFA，是在合成过程中用于脱保护和裂解的。需要去除 TFA 并转为醋酸盐形式。杂质包括缺失肽和插入肽，也有可能脱保护产生的残基外消旋非对映异构体，并且不排除侧链氧化和二聚体等杂质。
Analytical HPLC trace of the crude peptide A mixture. HPLC conditions: C18 (15 cm x 0.21 cm,1.8 μm); 0.4 mL/min; 220 nm; 60 ◦C; mobile phase A: Water with 0.1 % TFA; B: ACN with 0.1 % TFA; gradient: 20 % to 35 % B from 0 to 30 min, 35 % to 95 % B from 30 to 40 min, 95 % B from 40 to 45 min.
尝试采用 TFA 添加剂用 RPLC 制备
通过制备液相一步纯化粗肽。使用 TFA 作为添加剂，在 3 cm ID Luna C18 (2) 柱上于室温下在乙腈/水体系中对粗品进行制备小试。收集目标馏分，并使用短梯度条件通过 HPLC 重新分析。结果表明 TFA 的添加可能在纯化过程中引起差向异构化，并在旋蒸和冻干过程中进一步产生降解杂质。
Figure S-1. Analytical HPLC traces. a) the standard, b) fresh preparative HPLC fraction and c) the HPLC fraction after evaporation and lyophilization. Analytical HPLC conditions: Lunar C18 (2) (15 cm x 0.46 cm, 3 μm), 1 mL/min; 220nm; 40 ℃; mobile phase A: Water with 0.1% TFA; B: ACN with 0.1% TFA; gradient: 10% to 90% B from 0 to 10 min. 90% B from 10 to 15 min.
尝试采用 TFA 添加剂用 SFC 制备
接下来，我们在 MeOH/水/CO2 中以 TFA 作为添加剂，通过 SFC 直接纯化粗品。最初的纯化策略是先在 TFA 中进行纯化，然后用醋酸铵进行转盐。
Fig. 3. Preparative SFC of the crude peptide A. SFC conditions: Princeton CN (25 cm x 3 cm, 5 μm); mobile phase A: pressurized liquid CO₂; mobile phase B: MeOH:H₂O:TFA (95:5:0.1); gradient: 35% B for 1 min, 35% to 55% B from 1 to 4 min, hold at 55% B for 2 min; 130 mL/min; 220 nm; 35℃; sample in DMSO; loading: 1 mL/injection.a) single injection,b) sequential injection.
在 3 cm ID CN（氨基）柱上以梯度模式在流速为 130 mL/min 和 35℃ 下以 7 分钟的循环时间进行的制备 SFC。单次进样量为30 mg（1.0 mL，浓度为 30 mg/mL，DMSO 溶液）。由于纯化采用梯度模式而非堆叠进样，因此采用顺序进样模式排样。显然，为了利用堆叠进样来提高通量，需要开发周期短的等度条件。虽然制备型 SFC 能够去除大多数杂质，以 >90% 的纯度提供纯化的肽 A，但在 SFC 纯化后观察到大量甲酯形成和降解。共溶剂甲醇可能具有与序列中唯一的酸性氨基酸残基发生反应，导致甲酯形成。SFC 实验也表明，TFA 不太适合于此粗品的制备纯化。总之，需要使用替代缓冲液来替代 TFA，以解决/消除降解和甲酯杂质的形成。
尝试采用乙酸铵添加剂用 RPLC 制备
用醋酸铵（NH4OAc）代替 TFA 作为缓冲液。在 3 cm ID Luna C18 (2) 上以乙腈/水为缓冲液对粗品进行制备。
Fig. 4. Preparative HPLC purification of the crude peptide A. HPLC conditions: Luna C18(2) (25 cm x 3 cm, 5 μm); 40 mL/min;220 nm; mobile phaseA: 95 % water/5 % ACN with 10 mM NH4OAc; B: 5 % water/95 % ACN with 10 mM NH4OAc; gradient: 35 % to 40 % B from 0 to 9.5 min, 40 % to 95 % B from 9.5 to 10.5 min, 95% B from 10.5 to 18 min. a) ambient, b) 65℃.
每次进样 200 mg（2 mL）。由于乙酸铵中目标物的峰形在室温下非常宽，因此将温度升至 65 ℃ 使目标峰变得尖锐提高分辨率。在65 ℃ 下进行制备运行后，目标馏分的 HPLC 纯度提高到 89 %，且回收率更高，而在室温下的纯度为 80 %，回收率较低。虽然纯化过程中采用醋酸铵作为缓冲液，但冻干后的目标物中仍然含有从粗品原料中带入了大量 TFA。由于反相制备时间长，后处理耗时等问题使得制备型 HPLC 不适用于扩大规模，因此未进一步研究优化条件。为了将纯度提高到 >95%。还尝试了使用醋酸铵作为缓冲液进行 SFC 纯化，但这并不能完全去除粗品合成中的 TFA。
中压 + SFC 的两步纯化
Fig. 5. An integrated two-step orthogonal purification process.
第一步通过中压 Flash 完成目标物的富集以及 TFA 的洗脱/转盐，第二部 SFC 精纯目标物。SFC 正相保留行为成为分析和制备模式下反相液相色谱的补充技术，并且制备通量和低溶剂使用，使得规模化纯化肽更方便。
95/5 水/ACN（10 mM NH4OAc）下进行十柱体积的清洗。此清洗步骤的目的是将目标保留在 C18 固定相上，同时允许过量的 TFA 盐和极性杂质在清洗过程中被洗脱和去除。后采用平缓梯度（从 20% 到 35% B）将更具保留性的杂质与目标分离。目标洗脱后采用从 35% B 到 100% B 的陡梯度。中压纯化从 50% 的粗品纯度得到平均纯度 >80% 的中心馏分，TFA 含量低于 0.1%（通过氟 NMR 测定），因为大部分TFA被NH4OAc 取代。该工艺进一步成功放大到 950g C18 Flash 柱，流速 250 mL/min，每次进样装载 5-20 g 粗品。
等度 SFC 条件：45% 甲醇/乙腈/水 (90/5/5)，15 mM NH4OAc， CO2，3 mL/min，140 bar BPR，220 nm。a) 40℃；b) 65℃。
SFC 上使用乙酸铵做改性剂，筛选了手性和非手性固定相，选择 2-EP（2-乙基吡啶）。并且尝试优化了温度（对于 SFC 来说，柱温也是改善峰型的因素之一）。
放大：等度 SFC 条件：2-EP（25 × 5 cm，5 μm），55% MeOH/ACN/水（90/5/5），含 15 mM NH4OAc，CO2，270 mL/min， 220 nm，100 Bar BPR，60 ℃，样品浓度：40 mg/mL，1.0 mL/ 注射。a) 单次注射，b) 每 2.5 分钟叠加进样一次
SFC 馏分的纯度 >95%，回收率 >70%。经过 SFC 纯化和冻干后，总共生产出 30 g 纯度 >95% 的目标多肽 A。
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