背景
日本某制药公司红曲保健品安全性问题引起国际上高度关注，截止 2024 年 9 月，已致多人死亡和就医。日本官方调查结果显示，该制药公司含红曲成分保健品原料中检出的软毛青霉酸是导致消费者肾功能障碍的原因。软毛青霉酸在数据库及文献中共报道有 2 种结构，分子量相同，互为同分异构体，主要经烯醇式互变异构产生。（1，2）软毛青霉酸的结构特殊性，导致分析难度大，目前尚无任何液质高灵敏度方法报道。此次事件使红曲的安全性得到高度重视，因此灵敏度高，专属性好的液质联用技术筛查技术的开发十分迫切。
图 1. 软毛青霉酸两种构型异构
软毛青霉酸不经衍生化直接质谱检测时需要使用碱性流动相如 0.1% 氨水才能离子化产生负离子模式下质谱信号，而使用碱性流动相时因其完全离子化从而在常规色谱柱上完全不能保留，无法与样品中其它成分实现有效分离，灵敏度大受影响。现有文献报道中也无法区分其两种构型异构。此次事件中日本方面使用液相色谱法进行检测，检出限接近 10mg/kg。无法满足实际筛查需要。
杭州市食品药品检验科学研究院伍勋团队联合 Phenomenex 携手 SCIEX 公司开发了创新性的利用三甲基硅烷化重氮甲烷对软毛青霉酸中的羟基进行甲基化衍生后检测的高灵敏度液质筛查方法。该方法通过衍生化使软毛青霉酸结构中的羟基衍生成甲氧基，从而能被色谱柱保留使其与红曲中其它成分分离，在 SCIEX 7500+ 质谱检测器中转而使用正离子模式检测，灵敏度大幅提升。使用 Phenomenex Kinetex C8 核-壳液相色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm）还能将软毛青霉酸两种构型异构进行色谱质谱表征。定量采用两种异构体峰面积之和定量，检出限 1μg/kg（上机浓度 1pg/ml），灵敏度是液相色谱的 1 万倍，线性范围 10-1000pg/ml，基质效应小于 5%，回收率在 92.69%-105.16% 之间。两种异构体衍生物在CID模式下质谱碎片相同，因此使用 SCIEX7600 高分辨质谱特有的 EAD 模式进行二级质谱解析确认。目前该检测方法已经申请发明专利，相关论文已经投稿，有望为国内红曲质量安全评估提供技术支撑。
图 2. A- 空白基质溶液（红曲生产企业：桐君谷生物医药科技（浙江）有限公司，批号 240303）；B- 对照品溶液；C- 阳性样品溶液；I- 软毛青霉酸 I；Ⅱ- 软毛青霉酸 Ⅱ
7500+ 的超高灵敏度结合创新方法，使用 Phenomenex Kinetex C8 (100 mm × 2.1 mm，2.6 μm) 实现软毛青霉酸同分异构体衍生物的色谱分离及定量，检出限低至 1μg/kg，灵敏度为液相色谱的 1 万倍，非衍生化方法检测的 100 倍。
ZenoTOF 7600 的 EAD 碎裂模式精准区分和鉴定软毛青霉酸的两种同分异构体。
Kinetex 色谱柱使用纳米级的溶胶凝胶处理技术，在实心硅核上生成均一稳定的多孔外壳。更高的色谱效率使得峰大幅变窄、变高，从而更容易检测出低含量杂质，柱效的增加显著提高了灵敏度。
参考文献
1) Masato I ,Shohei T ,Mihoko M , et al.In vitro and in vivo antimalarial activity of puberulic acid and its new analogs, viticolins A-C, produced by Penicillium sp. FKI-4410.[J].The Journal of antibiotics,2011,64(2):183-8.
2) Halton B, Harvey J .Electrocyclic Ring-Opening Reactions of gem-Dibromocyclopropanes in the Synthesis of Natural Products and Related Compounds[J].Synlett, 2006, 2006(13):1975-2000.DOI:10.1055/s-2006-948193.）。
