人体内约有 2 万个蛋白质编码基因，现有研究显示其中约有 10% 的蛋白和疾病发生有关，即约有 2000 个潜在靶点。然而根据 2017 年 NRDD 综述的统计，彼时 FDA 批准的 1578 个药物仅仅靶向了 667 种靶蛋白，其中小分子药物靶向了 549 种，大分子药物靶向了 146 种，仅占潜在靶点的 1/3。大量潜在靶点受限于小分子药物的局限性难以开发药物。或许我们可以借用期刊《Nature Reviews Drug Discovery》2022 年刊载的题为“PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue”的文献综述来一窥未来药物发展新篇章。
小分子靶向药物发展：从抑制到降解
小分子药物开发通常聚焦于筛选高亲和力的抑制剂。小分子抑制剂可通过与靶向蛋白的活性位点或变构位点紧密结合，需要持续占据该位点以阻断其功能，从而达到治疗效果，这是一种“占位驱动”（Occupancy-driven pharmacology）的作用模式。因此，传统小分子靶向药物具有以下特点：
需以高亲和力持续占据蛋白的活性位点
需足够高的药物剂量使靶点饱和
需半衰期足够长能持续抑制
“占位驱动”模式要求靶蛋白上具有可被小分子“占据”的明确“活性口袋”，而在已被解析的疾病相关蛋白中有高达 80% 的蛋白表面相对平滑，小分子难以稳定结合导致小分子抑制剂的效果不甚理想，这些靶蛋白通常也被称为难以成药的靶点。
另一方面，人体内存在天然蛋白质降解系统：泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统，其主要作用是维持细胞内的蛋白稳态，包括调节蛋白的数量以及异常蛋白的消除，因而靶向蛋白降解（Targeted protein degradation, TPD）技术成为近年药物发现领域一种极具前景的策略。其中，约有 80% 的蛋白由泛素-蛋白酶体系统（UPS）完成降解。
泛素－蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解。UPS 由泛素（ubiquitin, Ub）、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme, E1）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme, E2）、泛素连接酶（ubiquitin ligase, E3）、26S 蛋白酶体及底物蛋白构成。泛素是一个由 76 个氨基酸组成的多肽，广泛存在于各类真核细胞中。泛素经 E1 的活化后可和 E2 结合，随后在 E3 的催化下和底物蛋白上的一个赖氨酸残基结合，带上泛素标签的底物蛋白随后被 26S 蛋白酶体识别并降解。
E3 连接酶需要识别降解的蛋白并将泛素连接到该蛋白上，是 UPS 的关键因素，人体中约有 600 种 E3 连接酶，按照催化机制的不同可分为 RING、HECT、RBR 三大类：RING 可将和 E2 结合的泛素直接转移到底物上，而 HECT 和 RBR 先将泛素转移到自身上作为过渡，再将自身上的泛素转移到底物上。从数量来看，RING 类 E3 连接酶超过 500 种，而 HECT 和 RBR 类仅分别有 28 种和 14 种。
图 1. 泛素-蛋白酶体系统和 E3 泛素连接酶分类 ( a. 蛋白经 UPS降解示意图 b. 三种 E3 连接酶类型 c. RING 类 E3 连接酶 ) [2]
图 2. 靶向蛋白降解中不同结合模式对比（a. 通过 protac 分子将靶蛋白与 E3 泛素连接酶 CRBN 结合 b. 分子胶类免疫调节剂（immunomodulatory drug,IMiDs））[3]
目前，靶向蛋白降解剂可分为 PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）分子和分子胶（Molecular glue）两大类。
上世纪 90 年代初，哈佛大学的化学生物学家斯图尔特·施赖伯（Stuart Schreiber）团队发现环孢菌素 A 具有类似“胶水”的功能，将亲环素与钙调节神经磷酸酶这两种蛋白相结合，进而提出了“分子胶”的概念。分子胶通常为单价小分子（分子量小于 500Da），其具体作用机制为改变 E3 连接酶表面，从而阻断 E3 连接酶与天然底物的结合，诱导待降解的特定蛋白结合于 E3 连接酶，进一步促进特定蛋白的泛素化修饰，最后使其被蛋白酶体降解。其代表药物包括沙利度胺、来那度胺和泊马度胺等免疫调节剂（immunomodulatory drug, IMiDs），已在多发性骨髓瘤等疾病治疗中取得显著效果。
以沙利度胺（商品名“反应停”）为例，上世纪六十年代，沙利度胺因具有镇静催眠作用且能有效抑制孕妇晨吐，而被作为新型镇静催眠类非处方药在德国获批上市。随后，由于母亲在孕期过度服用沙利度胺而导致胎儿“海豹样肢体畸形”，引发了二十世纪最为著名的药害事件——“反应停事件”，这也是全球药物警戒史上的里程碑事件。随后，沙利度胺被发现对多种难治性疾病都具有较好的疗效，但其药理作用机制并不明确。直到后来科学家发现沙利度胺分子部分结构能够与 CRBN（E3 泛素连接酶）相互作用，另一部分能够连接至 IKZF1/3 蛋白，从而诱导该两种蛋白靠近，随后 CRBN 泛素化 IKZF1/3，导致 IKZF1/3 被蛋白酶体降解，继而调降下游 MYC/SALL4/IRF4/TNF-α 等蛋白的表达，从而发挥抗血管生成、抑制细胞增殖、抗炎症反应等作用。
图 3. 基于 UPS 的 PROTAC 的作用机制[1]
PROTAC 分子则由三部分构成：E3 泛素连接酶配体 、 靶蛋白配体及 Linker；E3 泛素连接酶配体负责特异性招募 E3 泛素连接酶；靶蛋白配体用于靶向和捕获目标蛋白。因此 ，PROTAC 分子能够将 E3 泛素连接酶募集到靶蛋白附近，为靶点蛋白贴上泛素标签。而在细胞中打上泛素标签的蛋白将被送入蛋白酶体进行降解。这样 PROTAC 分子就能够特异性地促进致病蛋白的降解。
传统抑制剂的“占位驱动”，需要足够大的药物剂量使靶点饱和；足够长的半衰期保证持续抑制；足够高的亲和力能竞争过原底物。随之也会带来诸多问题，如高剂量带来的毒副作用过大；高亲和力容易导致脱靶毒性及耐药性。相较于小分子靶向抑制剂“占位驱动”的模式，PROTAC 发挥作用不需与靶蛋白紧密结合，主要取决于 E3 连接酶和靶蛋白的相互靠近（事件驱动，Event-driven pharmacology）。药物无需直接抑制目标蛋白的功能活性，也无需与目标蛋白长时间和高强度的结合；理论上只要靶蛋白上有裂缝、缺口等可以提供短暂“着力点”即可，可以破坏蛋白质的酶和非酶功能（例如支架）或转录功能，而不是单单抑制蛋白的活性，可以克服传统小分子的耐药性。并且 PROTAC 引发靶蛋白降解后即可从复合物中解离，理论上可以循环使用。
表 1. PROTACs 与 分子胶降解剂 (Molecular Glue Degrader, MGDs) 参数对比[5]
目前，在人类基因组约 600 个 E3 泛素连接酶中，只有不到 10 个被开发用于靶向蛋白质降解，已公布的 PROTAC 分子中又以靶向 CRBN E3 泛素连接酶为主；而CRBN也成为了药物发现科学家最热衷于设计相关药物结构的研究方向，这很大程度源于以下因素：（a）在人体组织中广泛表达，（b）明确的作用机制，（c）明确证明的临床疗效，（d）靶向 CRBN 的化合物具有低分子量，类药性等特点。
表 2. 常用 E3 连接酶配体及其参数[5]
在 FDA 批准的相关药物中，沙利度胺 (Thalidomide)，来那度胺 (Lenalidomide) ，泊马度胺 (Pomalidomide) 以及试验药物伊伯多胺 (Iberdomide, CC-220) 或 CC-8859，这类药物均具有基于结合 CRBN 的异吲哚啉酮或邻苯二甲酰亚胺结构，唯一例外的是具有喹唑啉酮结构的试验药物 Avadomide。这三类传统的结合 CRBN 的结构不仅可以用来直接设计相关治疗药物，如今更被用来作为 Protac 药物中招募 E3 泛素连接酶的配体结构，已报导的药物包括在临床试验中的 ARV-471，ARV-110 和 NX-2127。
图 4. 传统靶向 CRBN 药物及试验药物[4]
如今，越来越多的研究人员正参与到 Protac 药物的结构设计中，在百时美施贵宝研究人员的一篇文献报道中，其团队设计和合成了一系列新型的结合 CRBN 的配体结构，并选取当中的部分结构用于考察和恩扎卢胺合成出靶向雄激素受体的 protac 分子。
图 5. 36 个Protac 分子设计与合成（基于靶向雄激素受体的恩扎卢胺，6 种不同长度的 linker 及 6 种新型 CRBN 的配体的组合）[4]
相关化合物经HPLC进行纯度快速分析[4]
碱性体系：
Gemini NX-C18（30 mm × 2.0 mm, 5 μm）；P/N：00A-4454-B0
流速：1.8 mL/min
时间/min | A/含 0.03% 碳酸铵和 0.375% 氨水的水溶液 | B/乙腈含 0.03% 碳酸铵和 0.375% 氨水 |
0.0 | 95 | 5 |
2.5 | 0 | 100 |
3.5 | 0 | 100 |
酸性体系：
Kinetex EVO C18（50 mm × 3.0 mm, 5 μm）；P/N：00B-4633-Y0
流速：2.2 mL/min
时间/min | A/水含 0.1% FA | B/乙腈含 0.1% FA |
0.0 | 95 | 5 |
2.5 | 0 | 100 |
3.5 | 0 | 100 |
代表性 HPLC 谱图[4]
在医药界万物皆可偶联的新时代，基于单抗和核酸的 Protac 蛋白降解剂组合也在探索和研究中，相信随着技术的成熟，会有越来越多的传统意义上的不成药靶点疾病被人类所治愈：一代药物终将老去，但总有新技术在兴起。
TWIN™ (二合一) 技术
Gemini C18 和 C6-Phenyl
在硅胶生产的最后阶段，我们会在上面杂化一层独特的有机硅胶层，从而形成一种全新的复合粒子。由于内部硅胶基质在这个生产过程中不会改变，这种粒子除了保留机械强度与硬度和出色的柱效外，硅胶有机外壳还可以保护粒子免受化学物质的侵蚀。
第二代 TWIN-NX 技术
Gemini NX-C18
TWIN-NX 使用改进型有机硅胶杂化工艺，这种技术可以形成高度稳定的乙基交联结构。这些有机基团均匀地融入硅胶表面的杂化层，同时保持纯净的硅胶核。这不仅能抵抗高 pH 值的侵蚀，而且还能保持硅胶颗粒的高效性和机械强度。
Kinetex EVO C18
在 1-12 的 pH 范围内开发稳定的方法
改善碱性化合物的峰形
轻松缩短运行时间并提高灵敏度
Kinetex EVO C18 采用了先进的有机硅胶杂化工艺，结合高度稳定的乙烷交联技术，能够在耐受高 pH 值腐蚀的同时保持核-壳颗粒的机械强度。
参考文献
1. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat Rev Drug Discov. 2022, 21, 181−200.
2. Proteolysis-targeting chimeras (PROTACs) in cancer therapy. Molecular Cancer. 2022, 21(1).
3. Advancing targeted protein degradation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 21, 638-654(2021).
4. Targeted protein degradation: expanding the toolbox. Nat Rev Drug Discov. 18, 949–963 (2019).
5. Design and Synthesis of Novel Cereblon Binders for Use in Targeted Protein Degradation. J. Med. Chem. 2023, 66, 16388−16409
6. 华创证券创新药系列研究：PROTAC蓄势待发，蛋白降解百花齐放.
7.太平洋证券创新无界系列之二：蛋白降解剂行业研究
