2020 年全球首款 mRNA 新型冠状病毒肺炎疫苗展现出的安全性和保护效力，不仅获得了紧急授权，更是让 mRNA 疫苗备受关注，同时唤起了人们对于使用 mRNA 表达治疗性蛋白的兴趣。相比传统蛋白分子，mRNA 具有成本低，模块化生产以及序列易调整等优势，具有广泛的应用前景，可应用于疾病预防、癌症疫苗、HIV 治疗性疫苗、脱敏疗法、蛋白质替代疗法、基因编辑和再生医学等多个领域。
近期，美国药典委员会（USP）发布了《mRNA 疫苗和治疗产品质量分析方法-指南草案》（第三版）。该草案规范了 mRNA 药物原料、mRNA 药物制剂的表征、质量放行的标准操作流程，其中在聚集体检测中采纳了 SEC-HPLC 法。
本文展示了飞诺美最新上市的 700 Å 孔径产品——biozen dSEC-7，应用于四种不同长度体外转录 mRNA（IVT mRNA，参见表 1）的聚集体分析。并且通过 MALS 检测器对聚集体的分子量进行估算，确证了该色谱柱对于 mRNA 单体和二聚/高聚体的分离能力，进一步证明该色谱柱适合于 mRNA 聚集体的质量研究和放行检测。
表 1. IVT mRNA 样品和蛋白对照品的详细信息
样品 | 名称 | 长度/分子量 |
1 | saRNA IVT mRNA | 8443 nt / 3055 kDa |
2 | Cas9 IVT mRNA | 4486 nt / 1452 kDa |
3 | Luciferase IVT mRNA | 1936 nt / 626 kDa |
4 | eGFP IVT mRNA | 998 nt/ 320 kDa |
5 | Thyroglobulin | 670 kDa |
6 | BSA | 66.5 kDa |
7 | Myoglobin | 17 kDa |
8 | Uridine | 0.2 kDa |
SEC-HPLC 结果分析
我们首先按照 USP 收录的流动相（150 mM 磷酸钠缓冲液 pH 7.0），分别分析了 4 种不同长度的 IVT mRNA，以及 3 种蛋白和鸟苷的混标（参见图 1）。
图 1. 4 种 IVT mRNA 和 4 个蛋白混标的叠图
（蓝色：eGFP IVT mRNA；红色：Luciferase IVT mRNA；绿色：Cas9 IVT mRNA；粉色：saRNA IVT mRNA；淡绿色：3种蛋白和鸟苷的混标）
3 种长度约从 1,000 至 5,000 nt 的 IVT mRNA 分子均与其二聚及高聚体实现了比较好的分离。总长度接近 10,000 nt 的 saRNA IVT mRNA 没有检测到聚集体，可以观察到其洗脱的时间接近 Cas9 IVT mRNA 的聚集体，从侧面证明在该色谱柱上有足够的孔容量用于 Cas9 IVT mRNA 聚集体的分离；分子量为 670 kDa 的甲状腺球蛋白的峰形良好，和其聚集体也得到很好的分离（参见表 2）。在该色谱条件下，观察色谱柱的完全排阻体积大约在 1.7 mL， 而完全洗脱的体积大约是 3.9 mL。
表 2. 8 个样品的洗脱时间和聚集体分离度
样品名 | 主峰保留时间（min） | 聚集体分离度 |
saRNA IVT mRNA | 7.658 | n.a. |
Cas9 IVT mRNA | 8.168 | 0.87 |
Luciferase IVT mRNA | 9.366 | 1.17 |
eGFP IVT mRNA | 10.214 | 1.35 |
Thyroglobulin | 12.148 | 1.40 |
BSA | 13.876 | 1.03 |
Myoglobin | 14.513 | n.a. |
Uridine | 15.005 | n.a. |
SEC-MALS 结果分析
MALS 是一种光学技术，通常与 SEC 联用，以实现高精度的分子量测定。基于上述 SEC-HPLC 的分离，我们结合 MALS 检测器进一步确认了 3 种 IVT mRNA 的聚集体的分子量信息。结果参见图 2。利用 MALS 检测器估算的分子量表明先于主峰洗脱的确实是 IVT mRNA 的二聚/多聚体，同时该实验证实 biozen dSEC-7 优异的性能可以很好的适配 MALS 检测器。
图 2a. eGFP IVT mRNA 的 SEC-MALS 谱图
图 2b. Luciferase IVT mRNA 的 SEC-MALS 谱图
图 2c. Cas9 IVT mRNA 的 SEC-MALS 谱图
随着细胞和基因治疗技术的快速发展，越来越多的分析技术开始在 CGT 药物研发生产全生命周期中被应用，以提高检测的效率和确保分析结果的可靠性。SEC 体积排阻色谱法主要用于表征和监测生物分子的尺寸变异体，在该领域中被越来越广泛的认可和使用。飞诺美的 Biozen dSEC-7 是一款拥有特殊修饰的 700 Å 大孔 SEC 柱，因为具有优化的孔径分布和 3 μm 的粒径，使得该色谱柱拥有良好的分离能力。Biozen dSEC-7 还采用了 BioTi 生物惰性硬件，进一步降低了色谱柱硬件和生物大分子之间的次级相互作用，提高了结果的稳定性。
此项应用的 IVT mRNA 样品提供来自丹纳赫中国生命科学战略合作伙伴——云舟生物科技（广州）有限公司。此次项目也将进一步作为双方合作的标杆示范项目，为双方未来开展更多行业领先方法和工艺研究，包括AAV、mRNA和基因药物载体平台方案带来更多合作空间。
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云舟生物是引领全球基因递送技术的创新型企业，可提供科研载体构建服务、基因递送 CRO 服务、基因载体 CDMO 服务等全产业链服务。云舟生物通过全球首创的智慧基因载体智能设计与订购平台“载体家（VectorBuilder）”，开启了定制化基因载体的商品化时代，助力全球科研机构与药企研发人员提升基因研究效率和基因治疗创新效率。针对基因递送在基因疗法中应用的关键技术瓶颈，云舟生物深耕质粒载体、慢病毒载体、AAV 病毒载体、LNP-mRNA 等多种基因递送平台技术，并结合自身 CRO 和 CDMO 服务平台，加速创新基因疗法从科研到临床的转化。
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