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继登上国际最权威学术期刊之一 Cell 后，近日，国科大杭州高等研究院周斌教授工作室合作研究成果「Intercellular genetic tracing by alternative synthetic Notch signaling」又在国际学术期刊 Cell Discovery 在线发表！该研究结合合成生物学技术与遗传学技术，构建了体内邻近细胞遗传标记新技术，并揭示在胚胎发育及器官生成过程中存在不同细胞类型之间的细胞通讯现象。该工作为人们了解早期器官发育及对临床早期发育异常疾病的诊治提供了研究基础，也为开展体内邻近细胞研究提供了重要技术支持。
细胞与细胞交流参与维持生物体正常功能，因此，开发用于研究细胞与细胞交流的遗传操作新技术，对于更好了解体内复杂生物学事件的微环境调控及其分子机制具有重要意义。近期，周斌团队基于 Notch 信号通路工作原理，在体内构建人工合成的 Notch 信号通路，称为 Synthetic Notch（synNotch），利用 synNotch 首次在哺乳动物体内创建了邻近细胞遗传示踪技术（genetic tracing of cell-cell contact，gTCCC）。
该技术原理是将 Notch 配体的胞外段替换为 synNotch 配体 mGFP；将 Notch 受体的胞外段替换为 synNotch 受体 anti-GFP，而胞内段替换为 tTA，跨膜域保持不变；再结合 tetO-on 与 Cre-loxP 系统，当表达 synNotch 受体的细胞与表达 synNotch 配体的细胞发生接触时，就可以实现对受体细胞进行遗传标记及操作（Science，2022；Dev Cell，2023）。
在本项研究中，研究人员开发出多种基于 synNotch 技术的邻近细胞标记新技术。首先根据 mCD19 和 anti-CD19 构建 synNotch 技术用于邻近细胞标记，简称为 gTCCC2。研究人员构建了两种诱导型 mCD19 配体工具小鼠：R26-L-mCD19 和 R26-R-mCD19，以及一种 anti-CD19 内皮细胞受体工具小鼠：Cdh5-aCD19NtTA-tdT。研究人员以心肌细胞与内皮细胞接触为例对 gTCCC2 技术进行鉴定。
研究人员首先获得 Tnni3-Dre;R26-R-mCD19;Cdh5-aCD19NtTA-tdT;tet-Cre 四基因型小鼠检测心肌细胞是否与内皮细胞发生直接接触。在四基因型工具鼠中，心肌细胞表达 mCD19，与内皮细胞接触时 mCD19 会识别内皮细胞膜表面的 anti-mCD19，从而释放 tTA 入核启动 tet-Cre 表达从而介导 Cre-loxP 重组，将内皮细胞（受体细胞）标记为 tdT+。通过对新生期小鼠进行鉴定，研究人员成功检测到心脏内皮细胞被高效率标记，以上说明 gTCCC2 技术构建成功。
类似的，研究人员另一方面利用 mCherry 和 anti-mCherry 构建第三种邻近细胞标记技术 gTCCC3。通过免疫荧光染色，研究人员发现成纤维细胞与内皮细胞邻近分布。为验证这两种细胞类型是否发生细胞接触交流，研究人员构建了 Pdgfra-mCherry 小鼠可使成纤维细胞表达 synNotch 配体 mCherry，同时构建了两种版本表达 anti-mCherry 的内皮细胞工具小鼠，Cdh5-amCh2NtTA-BFP 和 Cdh5-amCh4NtTA-BFP。
理论上，在 Pdgfra-mCherry;Cdh5-amChNtTA-BFP;tet-Cre 小鼠中，当内皮细胞与成纤维细胞发生接触时，内皮细胞被标记为 BFP+。通过体内验证，研究人员检测到新生期小鼠多种器官中内皮细胞被标记，这说明在胚胎发育中，成纤维细胞与内皮细胞会发生直接接触交流从而参与器官生成。另外，研究人员也在体内成功验证了三种基于 synNotch 的邻近标记技术：gTCCC，gTCCC2，gTCCC3 不会发生交叉识别，可以正交使用。
综上，研究人员基于 synNotch 成功构建出两种体内细胞邻近遗传操作技术，结合 Cre-loxP 系统可对接触细胞进行特异性遗传学操作，以上三种 gTCCC 技术为进行体内复杂的细胞与细胞交流研究提供了重要的遗传学技术支持。
杭高院为该工作的第一完成单位。杭高院周斌课题组副研究员刘扩与中国科学院分子细胞科学卓越创新中心张少华博士为该论文共同第一作者。复旦大学附属中山医院王利新教授与杭高院周斌研究员为该论文共同通讯作者。该研究得到分子细胞卓越中心动物平台和细胞平台的大力支持。该工作得到基金委、科技部、新基石科学基金会、杭高院基金等支持。
图注：邻近细胞遗传操作技术 gTCCC2 和 gTCCC3
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41421-024-00721-9
来源：国科大杭州高等研究院
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