Nat Commun丨突破性发现：臂旁Calca神经元介导二阶条件反射

文摘 2024-11-16 09:01 上海

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学会将直接和间接的线索与生物学上重要的事件联系起来对于生存至关重要。二阶条件反射（SOC）涉及在没有无条件刺激（US）存在的情况下，形成一个先前被强化的条件刺激（CS1）与一个新的条件刺激（CS2）之间的关联。然而，介导SOC的神经机制仍然不清楚。

2024年11月9日，美国华盛顿大学霍华德·休斯医学研究所Richard D. Palmiter研究团队在Nature communications杂志发表“Parabrachial Calca neurons mediate secondorder conditioning”揭示了臂旁Calca神经元介导二阶条件反射。

臂旁Calca神经元对有害的US有反应，并且在与US配对后也对CS有反应，这表明Calca神经元介导SOC。作者在小鼠中建立了一个厌恶性SOC行为范式，并通过单细胞钙成像在条件作用和随后的回忆阶段监测Calca神经元的活动。这些神经元在SOC后被CS1和CS2激活。在CS1-CS2配对期间化学遗传学抑制Calca神经元减弱了SOC。因此，通过学习到的CS重新激活US通路在形成旧CS和新CS之间的关联中起着重要作用，促进了二阶记忆的形成。

图一二阶恐惧条件范式验证及应用

作者实施了一个二阶恐惧条件范式，包括四个连续阶段：习惯化、一阶关联（CS1-US配对）、二阶关联（CS2-CS1配对）以及对CS2的条件性僵直反应的测试。在实验的第一天，小鼠习惯于10个光线索（一阶CS1）和10个声音线索（二阶CS2），以随机顺序呈现。小鼠接受了10次光CS1（10秒，60勒克斯）与足底电击US（0.5毫安，0.5秒）。研究者测量了对光CS1的僵直行为，以记录学习情况。第三天，小鼠四次接触到音调CS2（10秒，70分贝），0.5秒后是光CS1，以建立二级联想。对照组（仅接受CS1）没有进行CS2-CS1配对，作为比较的基线。CS2-CS1联想试验的次数基于先前的大鼠研究并限制在最小化，以减少CS1的消退。对照组和实验组在没有任何额外线索的情况下在室内表现出适度的僵直，可能是由于第二天与环境恐惧有关。在CS2-CS1配对阶段，对光CS1的僵直增加，反映了它们对与US关联的记忆。在第四天，测试阶段，小鼠在新环境中三次接触到音调CS2（相隔120秒）以测试二级记忆。与对照组相比，小鼠对音调CS2表现出显著的僵直水平。对音调CS2的僵直时间百分比比在CS2-CS1配对阶段对光CS1的僵直时间百分比低。在为CS2建立二阶恐惧记忆后，小鼠在测试日被呈现新的10千赫兹或5千赫兹音调CS2。小鼠对10千赫兹音调的僵直比5千赫兹音调少，表明小鼠在SOC后能够区分这些音调。这一结果表明，在这些实验条件下，二阶记忆不会泛化到类似类型的刺激。作者接下来仅在CS1-US配对阶段使用金属箱，并在不同的情境中进行CS2-CS1配对。观察到小鼠在这个修改后的范式中仍然对声音CS2显示出高水平的僵直，这表明声音CS2通过与光CS1的关联引发僵直反应在FOC中，最初中性的CS1在学会后成为US的预测信号。因此，假设只有在CS2先于CS1时才会形成二阶关联。接受两次条件试验的小鼠的僵直时间与只有一次的小鼠没有显著差异。鉴于记忆巩固在联合学习中发展长期记忆的重要性，还测试了二阶记忆是否依赖于巩固期。结果表明，在SOC范式中，形成二阶记忆需要时间。

图二在二阶记忆期间CGRP^PBN神经元活动记录

作者假设CGRP^PBN神经元会在二阶条件反射后被声音CS2激活，就像它们在一阶条件反射后被光CS1重新激活一样。为了探究不同阶段的CGRP^PBN神经元活动，将AAV-DIO-GCaMP6m病毒注入Calca^Cre/+小鼠的PBN，并在PBN的外侧区域植入GRIN镜头，对自由移动小鼠进行钙成像。在习惯化（第一天）期间，成像的199个CGRP^PBN神经元的平均荧光对声音或光没有变化。在第二天，小鼠经历10次与足部电击US同时终止的光CS1。在第二天成像的103个神经元中，80.6%的CGRP^PBN神经元在足部电击后强烈响应。在早期（1-2次）和晚期（9-10次）试验之间，对光CS1的GCaMP反应有显著增加。在第三天，小鼠被暴露于4次声音CS2和光CS1，间隔0.5秒。作者观察到CGRP^PBN神经元被光CS1激活。在成像的197个神经元中，43.7%的CGRP^PBN神经元被光CS1激活，27.4%的神经元被声音CS2激活，且对声音CS2的反应在试验中没有显著差异。在测试时成像的209个CGRP^PBN神经元中，41.2%被声音CS2激活，53.1%没有反应，5.7%被抑制。这些结果揭示了CGRP^PBN神经元天对US有反应，并在FOC后对CS1和SOC后对CS2有反应。这一进展强调了CGRP^PBN神经元将直接和间接线索与厌恶性刺激联系起来的适应性。

图三在CS2-CS1配对期间抑制CGRP^PBN神经元会减弱二阶条件反射

接下来，作者在Calca^Cre/+小鼠的PBN中双侧注射AAV-DIO-hM4Di-mCherry病毒运用化学遗传学探究CGRP^PBN神经元在二阶条件反射中的必要性。4周后小鼠经历了习惯化和CS1-US配对阶段。第二天，在CS2-CS1配对前30分钟，给予小鼠CNO，检测了对声音CS2的僵直反应。通过CNO处理抑制CGRP^PBN神经元并没有影响CS2-CS1配对期间的僵直反应。然而，在二阶关联期间化学遗传学抑制CGRP^PBN神经元导致在测试时对声音CS2的僵直水平显著降低。此外，与对照组相比，抑制CGRP^PBN神经元在10秒声音CS2呈现后显示出减少的僵直反应。SOC后对光CS1的僵直反应保持完整。化学遗传学抑制组对声音CS2的僵直反应仅为对光CS1反应的31.6%，表明二阶记忆的强度有所降低。这些结果表明，CGRP^PBN神经元的活动对二阶关联有重要作用。

总结

即使在没有非条件刺激的情况下，小鼠也能通过一级条件反射形成二级联想。通过单光子钙成像技术记录了CGRP^PBN神经元在整个学习过程中的动态反应，揭示了这些神经元在二级条件反射形成中的重要作用。高阶恐惧条件作用的神经机制研究可能为恐惧和焦虑相关障碍的治疗提供进一步的见解。

文章来源

https://doi.org/10.1038/s41467-024-53977-w

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