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目录
一．模型概述
二．实验原理
三．实验材料
四．实验设备
五．实验程序
六．数据收集与统计分析
七．注意事项
八．方案的优缺点
动物间的打闹是一种复杂的社交行为，在哺乳动物中高度保守，从啮齿动物到人类的几种哺乳动物物种的幼年中均可以观察到。打闹是高度复杂的，涉及同种动物之间的动态相互作用，对于在以后的生活中发展适当的社交、认知和情感行为是必要的。在大多数物种中，雄性在幼年时比雌性更频繁、更激烈地争斗玩耍，称为粗暴游戏（rough-and-tumble play ，RTP）或玩耍打架（play fighting）。这反映了大脑环路和发育中微妙而又有影响力的性别差异。在本方案中，描述了一种行为测试范式，以评估雄性和雌性幼年大鼠的社交游戏。本方案重点介绍了将RTP与其他与打闹相关的社交行为区分开来的行为评分标准。通过分析两个性别的差异，RTP行为可以作为理解社交行为的性别特定发展和表达的有力工具。当与早期药理学或遗传操作相结合时，该方案可用于研究大脑性分化的过程和社交行为环路的发展，或者，该方案可以作为单一试验进行，以研究潜在RTP神经环路激活的性别差异。粗暴的嬉戏或打闹是许多哺乳动物幼年时期的重要经历，是最常见的社交游戏形式，因为它促进了社交技能的发展，对于某些物种来说，打架游戏被保留到成年期，作为评估和管理社交关系的工具。RTP涉及竞争以获得优势，但有两个特点使它与严肃的打架不同。首先，它是高度愉悦的，并与积极的情感状态相关。其次，通过合作来调节竞争，确保互动在合作伙伴之间具有一定程度的互惠或轮流。也就是说，拥有优势的一方可以自愿放弃，从而允许角色互换发生，原来的防守者有机会成为攻击者。因此，尽管在打架玩耍中执行的动作可以准确地描述为攻击、防御和反击，但它们的使用情境不应与攻击性相混淆。出于这个原因，一般将这种打闹称为粗暴游戏（rough-and-tumble play ，RTP），以突出这些互动的合作方面。鉴于RTP是自然发生的，因此不需要实验训练来教动物玩耍。大鼠是研究RTP的一个特别好的模型物种，大鼠的RTP涉及竞争接近伙伴的颈背，如果接触，就用鼻子蹭。使用各种策略来攻击和防御颈背，包括在成功防御后发起反击。这种行为与严肃攻击不同，而且因为严肃攻击涉及攻击其他身体目标，即侧面和臀部，如果接触就会被咬伤。因此，当一场嬉戏的玩耍升级为严重的攻击时，可以很容易地辨别出来，因为侵略者从攻击颈背转向咬同伴的后背。由于超声波发声 （USV） 的使用对于竞争期间的交流至关重要，因此可以促进角色转换并避免升级为攻击（当大鼠进行嬉戏的互动时，它们会发出令人愉悦的 50 kHz 超声波发声，其与RTP的关系可参考综述：DOI：10.1007/7854_2015_432）。 1．雄性和雌性幼年（4-5周龄）Sprague-Dawley大鼠a．将动物保持在12：12小时的反向光照：黑暗循环中。b．将每一只大鼠都与年龄、性别和给药处理相匹配的非兄弟姐妹同伴配对，这些“玩耍对”将在多天的测试中保持不变，以便每只动物每天都与同一个玩耍伙伴一起玩耍。实验包括来自至少两个独立窝别的大鼠。根据实验条件的数量，将测试至少两组玩耍对（2组配对的窝，或总共4窝）c．出生时，通过剔除一定数量的幼崽，保持每窝的幼崽数为12-14只，以避免营养过剩/营养不足和产妇护理的混淆。每窝幼崽尽可能保持性别和药物处理平衡。并且由于产前睾酮在子宫内的潜在影响，不使用初始性别比（雄性：雌性或者雌性：雄性）大于 >2：1 的窝别。d．在实验室大鼠中，RTP在出生后第三周开始出现，在第四周和第五周之间达到高峰，然后随着青春期的开始而下降，但一直持续到成年期，尽管水平较低。虽然玩耍的动机可以被主要来自母亲的早期经历所改变，但是一旦玩耍在出生后17天左右开始，大约需要10天的时间才能完全成熟，这种成熟几乎没有受到饲养经历的影响。 根据正在研究的假设和处理的实验时间，动物可能需要在生命的早期接受药物处理（如产前暴露，产后雄性化等）。![]()
图1．具有代表性的实验时间轴和行为说明。 A．在出生当天，对两窝幼崽进行性别鉴定、扑杀和给药处理（如有必要），并将幼崽分配到性别和药物处理匹配的对中。幼崽可以不受干扰地生长，直到幼年。从 P26 开始，在整个青少年时期每天都可以评估RTP行为。B．描绘大鼠进行三种主要粗暴游戏行为的插图——扑击、钉击和拳击1．定制的有机玻璃测试场：49 cm x 37 cm，高 24 cm（见图 2A）。测试后可以使用几种不同的清洁溶液对测试场进行消毒，但要保证测试时干燥无味。![]()
图2．测试场和设置。 A．单个行为测试场的图像。B．在三脚架前布置的四个测试场的图像，用于视频录制
b．如果一次测试多对动物，请布置所有测试场，以便记录设备可以充分记录它们。使用智能手机录制，能够同时记录 4个测试场，并具有足够的细节和分辨率，见图2B。c．在每个测试场中填充足够的新鲜垫料，以覆盖测试场的底部（约2-3 cm深）。d．设计玩耍对和行为测试的顺序。每天需要更改测试顺序，以平衡所有测试日中每组的测试时间。2．在测试当天，将动物（在饲养笼中）从饲养室移入行为测试房间，让它们适应实验环境（测试前约20分钟和黑暗周期开始后至少1小时）。在黑暗期（大鼠的活跃期）进行测试对于正确的行为分析至关重要。3．用毛皮标记笔（在头部或背部）或用永久性记号笔在尾巴上做标记，标记每对玩耍对中的一只动物。这有助于行为分析，因为更容易识别有标记或未标记的动物的特定行为。4．一旦动物适应了，将一对动物放入测试场中，让动物适应测试场2分钟。 6．测试结束后，停止录制。将动物从测试场中移出，并将它们放回笼子里。7．根据需要多次重复步骤4-6，直到所有动物都经过测试。8．在随后的几天中，重复步骤 2-7。通常连续进行 4 天 （P27-30） 的测试，以捕捉峰值玩耍行为的性别差异；然而，在整个青少年时期（大约P26-35），可以每天重复测试。1．行为由对动物的性别和药物处理并不清楚的实验者离线评分。评分可以手动完成，也可以使用相关事件记录软件完成。2．对执行特定行为的动物进行该行为的评分。因此，一个玩耍对产生两个数据点。这有助于提高数据的可解释性，因为高水平和低水平玩耍的动物不会与它们的玩耍伙伴的行为相平均。此外，每只动物的行为评分允许对每只动物进行一段时间的分析，以获得所有测试日的平均玩耍值。3．为了评估粗暴的打闹行为，需要对以下行为进行评分（图 1B）：a．扑击：当一只动物向另一只动物的颈背或背部扑击时得分。这通常是一个剧烈的动作，并被将分数计给执行猛扑的动物。动物可能会用力撞到对方或进行不那么猛烈的扑击。这些通常不计分，因为开始玩耍的意图比较模棱两可。b．钉击：当一只猛扑的动物完全翻转到另一只动物的背上（四肢全部离开地面）时得分。扑击的动物通常也能得到钉击行为的得分，通常在猛扑后直接钉击另一只动物。 钉击通常是动物在继续比赛的时候被防守的结果。然而，这种动物可能会翻到自己的一边，保持它们脚上的重量。在这些情况下，不计入得分。c．拳击：当两只动物用后腿站起来并用爪子互相攻击时得分。此时，两只动物都可以获得拳击分数。拳击的频率远低于扑击或钉击，并且经常在追逐回合后观察到，即当被追逐的动物转身与追逐者对峙时。相应行为的视频可以参考：DOI:10.21769/BioProtoc.3481.4．以下行为也可以评分，但被认为是社交或运动玩耍行为：a．追逐：当一只动物主动追逐另一只动物时得分。只有“追逐者”才能获得追逐的分数。b．弹跳步态：当一只动物在测试场上以一系列“跳跃”的方式移动时得分。a．肛门生殖器嗅探：当一只动物主动嗅探另一只动物的肛门生殖器区域时得分。b． 舔舐和梳理：当一只动物主动舔舐或梳理另一只动物的头部或肛门生殖器区域时得分。c．蜷缩：当两只动物坐在非常近的地方/相互接触但不进行任何其他形式的社交行为（嗅闻/舔/梳理）时得分。两只动物都因蜷缩得分。d．爬过：当一只动物从另一只动物身上或身下爬过时得分。a．在垫料中挖掘和挖洞：按一只动物在垫料中挖洞或筑巢的持续时间来评分。b．咀嚼垫料：按一只动物用爪子拿着一块垫料并咀嚼它的持续时间来评分。c．一般的测试场巡查：按一只动物嗅闻或后腿站立以探索测试场墙壁的持续时间来评分。1．如果年龄是感兴趣的实验因素，则可以将数据表示为每天的平均值，并使用重复测量方差分析进行分析（参见图3A）。2．如果对年龄不感兴趣，则可以对单个动物的所有日子的数据进行平均，并根据实验组的数量使用t检验或方差分析进行分析（参见图3B-3E）。![]()
图3．示例数据。 A．样本数据显示 P27-P30 中雄性和雌性大鼠幼崽每天的总打闹（扑击、钉击和拳击）情况。B．样本数据显示 A 在所有四个测试日中的平均总打闹数据。C-E来自 B 的样本数据分解为扑击 （C）、钉击 （D） 和拳击（E）的情况。数据表示为mean±SEM。蓝线和红线分别表示雄性和雌性。圆圈表示单个动物的值。* ：P < 0.05，** ：P < 0.01
1．在测试过程中，实验者应在窗帘后面或测试场的视线之外。此外，保持房间内安静，因为外部噪音可能会扰乱行为。2．没有必要在试验之间清洁测试场或更换垫料。在每个测试日结束时，再清洁测试场并更换垫料，为第二天做准备。3．请务必将红光强度保持在最低限度，以避免造成人为压力的测试环境。行为测试的照明通常小于50 勒克斯。此外，Sprague Dawley大鼠应使用红光，因为它们是白化品系，并且它们无法看到红光，使测试环境尽可能接近自然黑暗周期，以实现最佳行为测试。3．虽然大鼠在打闹过程中会发出超声波发声，但这并不影响RTP的表达。4．在第一个测试日之前，可以在旷场测试中测试动物的一般运动活动和探索行为，以排除组间活动差异的任何混淆。一般来说，雄性和雌性之间的基线活动没有差异，但实验操作可能会影响到这一点。5．在测试场中填充过多的垫料会导致社交行为的减少和环境探索的增加，因为动物会开始在垫料下挖洞。6．建议在反向光暗环中测试动物，并在黑暗周期开始后 1-2 小时开始行为测试。重要的是要在几天内保持一致的行为分析时间，以避免对行为产生任何昼夜节律影响。7．根据测试天数、动物年龄和药理学操作，动物可能在青春期开始时开始表现出性行为（约为 P40）。在这种范式中，不建议将性行为视为一种社交行为，因为它很少发生；但是，如果实验中观察到它经常发生，则可以将其作为一组单独的行为进行分析，以确定青春期是否提前发生。8．雄性和雌性玩耍行为是沿着从高到低的连续体表达的。虽然平均而言，雄性相对于雌性处于连续体的“高端”，但存在相当数量的自然个体变异。每组动物都可能有一些高水平打闹的雌性和低水平玩打闹的雄性。这种自然的行为变异性并不是将这些动物排除在分析之外的理由；相反，应设计具有足够样本量的实验来解决这一点。建议每种性别至少 8 只动物。 9．玩耍对应该是同样的性别，同样的实验处理。在给定的玩耍对中混合性别或实验处理可能会导致中间玩耍表型（即，更顽皮的伙伴会增加低玩耍大鼠的玩耍行为，反之亦然）。这里介绍的方案是一种二元范式，即选择成对的大鼠幼崽评估RTP行为，是最广泛使用的实验范式。大鼠可以与熟悉或陌生的同伴配对。由于二元范式中的大鼠在固定的持续时间（最常见的是5-20分钟）内进行测试，因此实验处理对整体玩耍量（通过发起的颈背攻击次数来衡量）和游戏风格（通过使用不同防御策略的频率来衡量）的影响可以在实验和对照对之间进行比较。这种控制水平对于药理学操作尤为重要，因为当药物达到其对大脑的峰值作用时，需要对动物进行测试。然而，二元范式实现的控制水平的缺点是大鼠失去了选择其玩耍伙伴的权力，因为选择同伴的是实验者。并非所有同伴都像玩伴一样有吸引力。当大鼠在有多个伙伴的小组中进行测试时，RTP不会均匀分布。相反，一些同伴比其他同伴更受青睐，这不仅仅是哪只动物最接近的结果，因为大鼠会离开场地一侧的动物陪伴，然后前往另一侧开始与特定同伴玩耍。也就是说，一些潜在的游戏伙伴比其他游戏伙伴更受欢迎。实验操作可能会改变大鼠区分玩伴的能力，这在标准的二元游戏范式中可能无法被发现，因为只能与一个同伴进行交互，可能导致错误的结论，即实验操作没有效果。因此，多动物范式可以来抵消从二元范式的缺点。事实上，更复杂的方法可用于连续记录和评分饲养笼中的RTP行为。二元测试，可以更好地控制特定大鼠如何与特定伴侣打交道，而饲养笼里的测试，或小组测试，允许动物控制与谁一起玩以及在哪里玩，两者结合将捕获这两种方法的优势，从而评估更深入的分析治疗对社交行为的影响。 有研究者提出了一个多层次的框架，用于对可能受实验操作影响的所有相关RTP方面进行评分，以及如何将测量的内容与所提出的问题相匹配的逻辑，具体方案请参考DOI：10.1002/cpz1.337。参考文献
[1] VANRYZIN J W, MARQUARDT A E, MCCARTHY M M. Assessing Rough-and-tumble Play Behavior in Juvenile Rats [J]. Bio Protoc, 2020, 10(1): e3481.
[2] PALAGI E, BURGHARDT G M, SMUTS B, et al. Rough-and-tumble play as a window on animal communication [J]. Biol Rev Camb Philos Soc, 2016, 91(2): 311-27.
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