【期刊】肉苁蓉内生细菌多样性及功能菌株的分离筛选

植物内生菌是一种在整个生命周期或部分时间寄生在植物组织内部且暂时对寄主组织并不引起明显病症的微生物，内生菌种类多样、分布广泛，是重要的微生物资源库^[1]。内生菌作为宿主植物的重要组成部分，对调节宿主体内的微生态平衡及促进宿主植物的健康生长均发挥重要作用^[2]。目前，关于内生菌多样性的研究方法主要基于传统培养方法^[3]。然而，仅靠传统培养方法不能全面地反映植物内生菌资源。高通量测序技术因其免培养、信息量大等优点，已广泛应用于环境微生物^[4]、肠道微生物^[5]、植物内生菌^[6]等微生物多样性及群落分析研究中。

肉苁蓉(Cistanche deserticola)是中国传统药用植物之一，为列当科植物。荒漠肉苁蓉或管花肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎^[7]，具有抗衰老^[8]、抗氧化^[9]、润肠通便^[10]等功能。现有研究表明，肉苁蓉存在丰富的内生真菌多样性，并发现不同种植地区、采用季节及植物部位其内生真菌组成存在一定的差异性^[11]。然而，有关肉苁蓉内生细菌多样性及相关资源筛选等研究鲜有报道。

本研究对新疆维吾尔自治区吐鲁番市高昌区管花肉苁蓉(GH)和荒漠肉苁蓉(HM)进行采样，利用高通量测序技术开展多样性及群落组成分析，并开展了肉苁蓉内生细菌的分离筛选，相关菌株通过抗逆、促生、抑菌特性测定，为进一步挖掘、利用肉苁蓉内生细菌提供研究基础和科学依据。

2.1  高通量测序结果

2.1.1  细菌多样性

从管花肉苁蓉(GH)和荒漠肉苁蓉(HM)样品共测得原始序列301 260条，过滤掉低质量序列并去除植物体内的线粒体、叶绿体相关序列后获得高质量有效序列300 063条(表1)。α多样性结果显示，不同肉苁蓉样品测序覆盖度为99.99%，可以较好反映样品中内生细菌的真实组成情况。Simpson指数和Shannon指数在2种肉苁蓉样品之间差异性不显著，而Chao1指数存在差异，并且HM样品高于GH样品，说明GH样品的群落丰度低于HM样品的群落丰度。

表1  不同样品内生细菌群落的α多样性分析

Table 1  Alpha diversity analysis of endophytic bacterial communities in different samples

不同小写字母表示差异显著

Different lowercase letters indicate significant differences.

2.1.2  OTU分析

分别对管花肉苁蓉(GH)和荒漠肉苁蓉(HM)所测序列以序列97%的一致性作为一个OTU，并绘制两者的韦恩图(图1)，实验总计获得   1 086个OTU，其中，GH和HM样品分别检测到特有OTU数为582和458个，而共有OTU仅有46个，占OTU总数的4.24%，表明2种肉苁蓉内生细菌组成存在明显差异。

图1  不同样品内生细菌群落OTU分布韦恩图

Figure 1  Venn diagram of OTUs distribution of endophytic bacterial communities in different samples.

2.1.3  细菌群落物种分析

群落多样性结果显示，管花肉苁蓉(GH)和荒漠肉苁蓉(HM)内生细菌共包括19个门 104个目226个属及一些未分类的细菌。在门水平上，主要涉及变形菌门(Proteobacteria)、芽孢杆菌门(Bacillota)、放线菌门(Actinomycetota)，酸杆菌门(Acidobacteriota)、绿弯菌门(Chloroflexi)等5个菌门，累计占各样品的98.00%以上。其中，变形菌门(Proteobacteria)为2种肉苁蓉的绝对优势菌门，分别占79.74%和67.68%，但其他菌门相对丰度上存在明显差异(图2)。

在目水平上(图3)，假单胞菌目(Pseudomonadales)、无胆甾原体目(Acholeplasmatales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、链霉菌目(Streptomycetales)、根瘤菌目(Rhizobiales)等5个菌目占各样品的86.62%。其中假单胞菌目(Pseudomonadales)作为两种肉苁蓉中共同的优势菌目，分别占41.61%和64.16%。但其他菌目的相对丰度存在明显差异，伯克氏菌目(Burkholderiales)和无胆甾原体目(Acholeplasmatales)分别占GH的32.67%和2.50%；HM样品中伯克氏菌目(Burkholderiales)和无胆甾原体目(Acholeplasmatales)分别占1.86%和29.53%。

物种的相关性热图可以直观地观察出群落菌群之间的丰度差异性、相似性和物种聚类关系，颜色越红代表的是菌群之间丰度差异越大，颜色越蓝代表群落丰度越小。选取2种肉苁蓉属水平前20的内生细菌群落进行差异分析，并绘制相关性热图(图4)。结果表明2种肉苁蓉样品在属水平上群落丰度存在明显差异。假单胞菌属(Pseudomonas)、Candidatus Phytoplasma、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、Methyloversatilis、链霉菌属(Streptomyces)等占各样品的85.21%。其中假单胞菌属(Pseudomonas)占比最大分别为54.90%、50.31%。但其他菌属相对丰度存在差异，罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)和Candidatus Phytoplasma是GH样品的优势菌属，分别占37.77%和4.31%；HM样品中Candidatus Phytoplasma和Methyloversatilis是优势菌属，分别占23.16%和0.80%。

图2  不同样品内生细菌门水平的相对丰度   GH：管花肉苁蓉. HM：荒漠肉苁蓉. 下同

Figure 2  Relative abundance of endophytic bacteria at the phylum level in different samples. GH: Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight. HM: C. deserticola Y.C. Ma. The same below.

图3  不同样品内生细菌目水平的相对丰度

Figure 3  Relative abundance of endophytic bacteria at the order level in different samples.

图4  不同样品内生细菌优势属的相关性热图

Figure 4  Heat map of dominant genus correlation of endophytic bacteria in different samples.

2.1.4  主成分分析

主成分分析(principal component analysis，PCA)结果表明(图5)，主成分分析1 (PC1)和主成分分析2 (PC2)对样品群落的贡献率分别为31.47%和22.56%，二者累计贡献率达到54.03%。在主成分分析图中，HM样品都分布在第三象限且样品间较为集中，表明群落结构差异较小，而GH样品分布较散且样品间距离较远，说明同种样品之间存在群落差异。同时，HM和GH样品间各点分布存在明显差异，表明不同肉苁蓉群落组成存在明显差异。

图5  不同样品内生细菌群落的主成分分析图

Figure 5  Principal component analysis plots of endophytic bacterial communities from different samples.

2.2  肉苁蓉可培养内生细菌的分离与鉴定结果

从肉苁蓉组织中共分离得到65株细菌(图6)，经16S rRNA基因序列BLAST比对，结果显示，肉苁蓉内生细菌归属于3个门20个属34个种，所获菌株与已知模式菌株16S rRNA基因序列相似性在99.04%−100%。其中，芽孢杆菌属(Bacillus，9种)种类最多，其次为假单胞菌属(Pseudomonas，3种)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus，3种)、微杆菌属(Microbacterium，2种)、糖丝菌属(Saccharothrix，2种)，其余菌属各1种。菌株的分类鉴定统计表见表2，采用MEGA 11.0软件利用NJ法构建系统发育树(图7和图8)。

图6  部分可培养内生细菌平板照片

Figure 6  Colonies plate photograph of some culturable endophytic bacteria. A: CS-4. B: NGW-3. C: NGW-4. D: RGW-4. E: AGT-3. F: NGW-2. G: TGW-4. H: GG-13.

表2  可培养内生细菌汇总表

Table 2  culturable endophytic bacteria summary table

图7  基于可培养内生细菌芽孢杆菌门菌株16S rRNA基因序列构建的系统发育树   括号中的序号为菌株的GenBank登录号；标尺0.02代表序列偏差值；分支点上的数字代表计算1 000次聚类的概率

Figure 7  Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence of cultivable endophytic bacteria Bacillota. The serial number in brackets is the GenBank accession number of the strain, and the value of 0.02 represents the sequence deviation value. The number at the node means the percentage of occurrence in 1 000 boot-strapped trees.

图8  基于可培养内生细菌变形菌门和放线菌门菌株16S rRNA基因序列构建的系统发育树   括号中的序号为菌株的GenBank登录号；标尺0.05代表序列偏差值；分支点上的数字代表计算1 000次聚类的概率

Figure 8  Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence of cultivable endophytic bacteria Proteobacteria and Actinomycetota. The serial number in brackets is the GenBank accession number of the strain, and the value of 0.05 represents the sequence deviation value. The number at the node means the percentage of occurrence in 1 000 boot-strapped trees.

2.3  菌株的抗逆及促生特性

进一步对65株内生细菌相关抗逆及促生特性进行分析(图9)，大多数菌株具有较强的抗逆特性。在耐盐特性方面，所有菌株均可在3%的NaCl条件下生长，并且23.53%的菌株可在10%的NaCl条件下生长。在耐旱特性方面，69.54%的菌株可在浓度为10% PEG6000条件下生长，26.12%的菌株可在浓度20% PEG6000时生长。结果表明大部分肉苁蓉内生细菌具有较强的抗逆特性。发现芽孢杆菌(5种)、假单胞菌(1种)、亮杆菌(Leucobacter，1种)及微球菌(Micrococcus，1种)在不同程度上抗逆特性能力较强。

在促生特性方面，26.47%的菌株在解无机磷培养基和固氮培养基呈现出不同程度的透明圈，41.18%的菌株在CAS培养基有明显的橙色晕圈产生，38.24%的菌株具有产IAA特性，发现芽孢杆菌(7种)、假单胞菌(1种)和乳酸菌(Lactiplantibacillus，1种)在不同程度上促生特性能力较强。

图9  可培养内生细菌的抗逆及促生特性统计   PSMs：溶磷作用；NF：固氮作用；CAS：铁载体；IAA：吲哚-3-乙酸

Figure 9  Statistics of stress-resistant and growth-promoting properties of culturable endophytic bacteria. PSMs: Phosphorus-solubilizing effect; NF: Nitrogen fixation; CAS: siderophores; IAA: Indole-3-acetic acid.

2.4  菌株的抑菌特性

2.4.1  抑制病原细菌的活性

进一步对菌株进行拮抗病原细菌特性的测定，结果统计如图10所示，29.41%的菌株均具有不同程度抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的特性，其中芽孢杆菌(6种)、乳酸菌(1种)、粪产碱杆菌(Alcaligenes，1种)抑制病原细菌能力较强。

图10  内生细菌抑制病原细菌特性统计

Figure 10  Statistics of the characteristics of endophytic bacteria inhibiting pathogenic bacteria.

2.4.2  抑制病原真菌的活性

进一步对菌株进行拮抗病原真菌特性的测定，结果统计如图11所示，35.29%的菌株对西瓜枯萎病菌和棉花枯萎病菌具有抑制特性，38.24%对核桃腐烂病菌具有抑制特性，23.53%具有抑制白色念珠菌特性，其中芽孢杆菌(8种)、假单胞菌(1种)、产碱杆菌(1种)抑制病原真菌能力较强，图12为部分菌株的抑菌效果展示。

图11  内生细菌抑制病原真菌特性统计

Figure 11  Statistics of characteristics of endophytic bacteria inhibiting pathogenic fungi.

图12  部分内生细菌的抑制细菌及真菌指示菌结果   A：白色念珠菌. B：枯草芽孢杆菌. C：核桃腐烂病菌. D：棉花枯萎病菌

Figure 12  Results of inhibitory bacterial and fungal indicators of some endophytic bacteria. A: C. albicans. B: B. subtilis. C:Cytcospora sp. D: Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum.

内生细菌存在于各种植物中，具有丰富的群落多样性，但往往因植物品种、种植环境、植物部位等的不同，导致内生菌组成结构和数量存在明显差异。目前，国内外学者已对多花黄精、南瓜、黑果枸杞、人参等药用或药食同源植物进行研究，均发现含有丰富的内生菌资源。蔡媛等^[25]采用高通量测序技术分析多花黄精内生细菌的多样性分析，发现其内生菌共涉及19个门432个属。黄子粤等^[26]对相同条件下5种不同品种南瓜茎部内生细菌群落多样性分析发现内生细菌存在丰富的多样性，但不同品种南瓜茎中内生细菌基于不同分类水平上存在差异。顾美英等^[13]发现黑果枸杞不同组织部位内生细菌群落多样性存在明显差异，其根部的内生细菌多样性最高。郭伟强等^[27]发现野生与栽培人参内生细菌群落多样性存在差异，尽管变形菌门占据主导地位，但在优势菌属方面不管在群落组成还是种类数量方面均存在较大差异。肉苁蓉素有“沙漠人参”之称，但有关肉苁蓉内生细菌多样性和组成差异鲜有报道。本研究首次利用高通量测序方法对管花肉苁蓉(GH)和荒漠肉苁蓉(HM)样品进行群落结构多样性分析，发现两者内生细菌共涉及细菌域19个门226个属及一些未分类的细菌，变形菌门是两种肉苁蓉共同的优势菌门，其与郭伟强等报道的人参内生细菌优势菌门相一致；然而，两种肉苁蓉样品共有OTU数仅为46个，占总OTU的4.24%，表明肉苁蓉根块样品内生菌组成存在明显种间差异。

目前，有关肉苁蓉内生菌资源挖掘相关报道较为有限，仅周峰^[11]从产于宁夏的荒漠肉苁蓉中分离到618株内生真菌，并发现不同种植地区、采收季节及植物部位其内生真菌组成存在一定的差异性。本研究对吐鲁番市高昌区肉苁蓉样品进行内生细菌分离鉴定，初步分离得到65株细菌，归属于3个门20个属34个种，其中芽孢杆菌属占比最大，为29.34%，与前人报道的其他药用植物如骆驼刺^[28]、葛根^[29]、乌檀^[30]等结果相似。同时，本研究也分离到多种高通量测序检出的假单胞菌属(Pseudomonas)、微杆菌属(Microbacterium)等菌属，而高通量测序结果中的多种肉苁蓉优势内生菌，如罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、Methyloversatilis、链霉菌属(Streptomyces)等菌株在此次研究中未分离获得，可能受研究中分离筛选的培养基种类、培养条件等因素的影响^[31]。同时，本研究分离获得的植物乳杆菌属(Lactiplantibacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)等11个属未在高通量结果中检出，表明通过可培养方法和加强培养组学研究能进一步补充和校正高通量测序结果误差^[32]。

植物内生菌往往具有促进植物生长^[33]、提高植物抗逆^[34]、抗病^[35]等特性。本研究对实验所获得的菌株抗逆和促生研究表明，23.53%的菌株可在10%的NaCl条件下生长；69.54%的菌株在10%的PEG6000条件下均可生长，表现出较强的耐盐、耐干旱特性。内生菌可以通过如固氮、溶磷、产铁载体及产IAA等不同方式促进植物的生长发育^[36]。本研究发现26.47%的肉苁蓉内生细菌具有解无机磷和固氮作用，41.18%的菌株可产生铁载体，38.24%的菌株可产IAA。同时，本研究也获得多株芽孢杆菌、乳酸菌、假单胞菌等对不同病原细菌及病原真菌具有拮抗作用的菌株。其中，芽孢杆菌是农业微生物菌剂的重要菌株，并在植物体内多有分布。王静怡等^[37]从棉花内生菌中获得4株棉花黄萎病拮抗菌，均为芽孢杆菌，并研发制备棉花黄萎病生防菌剂，发现该菌能较好地在土壤中定殖，其数量与防病效果呈显著正相关。乳酸菌常应用于发酵食品加工^[38]、临床治疗^[39]及作物防治^[40]，具有调节机体免疫力^[41]、维持肠道内菌群平衡、抗菌^[42]、降解重金属^[43]和促进机体生长等功能。本研究获得一株植物源植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum) CS-4，除具有较好的抑菌活性，还具有较强的抗逆促生特性。