摘要：

皮肤肥大细胞瘤（cMCTs）约占猫皮肤肿瘤的20%。由于这种肿瘤没有分级系统，很难估计预后。尽管皮肤肥大细胞瘤的典型表现是良性肿瘤，可以通过手术切除治愈，但有一些少见但重要的猫科cMCTs组分具有生物学侵袭性，可以扩散到局部淋巴结，先于弥漫性皮肤病发作，或与内脏受累相关。回顾性评估通过手术切除或不接受药物治疗的猫cMCTs病例的一些宏观和组织学特征。根据临床结果将猫分为2组。第一组包括手术后1000天未患肥大细胞肿瘤相关疾病的活猫。第2组包括在组织学上证实为转移性或皮肤播散性疾病的猫。根据各组之间最佳区分的标准来制定分级方案。第1组和第2组分别由48（76％）和15（24％）病例组成。如果在10个视野（400x）中有> 5个有丝分裂，并且至少符合以下两个标准，则肿瘤被归为高等级：肿瘤直径> 1.5 cm，核形状不规则和核仁突出/染色质簇。根据该方案，与48个低度肿瘤（中位数未达到；P < .001）相比，15个高等级cMCTs（24％）的生存时间（中位数349天；95％CI，0-739天）明显缩短（<.001）。有必要做进一步的研究来验证这种分级系统，并在更大的案例系列中测试重现性。

关键词：

猫，皮肤，猫科动物，肿瘤分级，肥大细胞肿瘤，肥大细胞瘤，预后

皮肤肥大细胞瘤（cMCTs）是猫第二常见的皮肤肿瘤，约占猫皮肤肿瘤的20%。

大多数猫cMCTs在临床上是良性的，但高达22%的病例可能表现出侵袭性，并最终导致淋巴结转移、内脏器官受累和/或皮肤扩散。

目前还没有猫cMCTs的分级系统，识别恶性肿瘤仍然是一个挑战。在大多数研究中，有丝分裂活性被认为是预测预后的唯一可靠的组织学参数；然而，在良性和恶性cMCTs之间观察到有丝分裂指数的显著重叠，表明多种参数的组合可能更好区分。

确定进一步预后指标的尝试是没有说服力。其中包括亚型的分类，生长模式，Patnaik分级系统的应用，细胞质颗粒的评估，以及伴随的炎症浸润的特征。同样，分子参数的评估，如试剂盒受体失调和细胞周期标志物的检测，可重复性较差。

当前研究的目的是选择一些参数，当这些参数组合到基本分级系统中时，可以令人满意地鉴定出具有侵袭性生物学行为的猫cMCTs。

病例检索自意大利博洛尼亚大学兽医科学系的医学数据库。有手术切除cMCTs病史且有可用临床和随访信息的猫被考虑纳入研究。所需信息包括人口统计数据、肿瘤特征（位置、数量、最大直径）、手术切缘状态、手术后局部复发或其他经组织学证实的原发性或转移性肥大细胞肿瘤（MCTs）的发展，无进展间隔期（PFI）、总生存期（OS）和死亡原因。只有当所有结节都已通过手术切除并可进行组织学检查时，患有多种cMCTs的猫才有资格入选。

根据临床结果将病例分为2组。手术后1000天存活且无MCT相关疾病的猫被分为第1组，而病例在以下至少1种情况下被分为2组：（1）显微镜下证实的淋巴结转移（即组织学或细胞学），（2）显微镜下确认的cMCT切除后内脏受累，和（3）显微镜下证实的皮肤扩散性肥大细胞病的发作（>10个结节）。不确定死因的猫或在手术后1000天内因与MCT无关的原因死亡的猫被排除在分析之外。

1.2组织学检查

所有组织学样本均固定在10%中性缓冲福尔马林中，并在提交时石蜡包埋。

用苏木精和伊红、甲苯胺蓝或吉姆萨对四微米切片进行染色，以确认先前的诊断。对于非典型cMCTs，CD18的免疫组织化学阴性（1:20，clone Fe3.9F2；P.F.Moore，白细胞抗原生物学实验室，加州大学戴维斯分校）和CD117的阳性（1:100，兔多克隆，A4502；Dako，Glostrup，丹麦）也需要纳入。

对苏木精和伊红染色的载玻片进行了盲检（S.S.）。根据现有文献，对每个肿瘤的不同组织学特征进行了评估，包括生长模式、皮下侵袭、组织类型、核质比、不规则核形状（核多形性）、核仁突出、染色质簇、异核细胞、多核细胞、固缩/核破裂、有丝分裂计数、肿瘤栓塞、嗜酸性粒细胞和淋巴聚集体。表1中提供了这些参数的定义。在多个cMCT的情况下，将级别最高的肿瘤纳入生存分析。

1.3分级系统的开发

评分系统的首选特征是：（1）二级模式，没有中间等级；（2）有限数量的参数和（3）算法方法，以简化应用；（4）使用数字参数，以提高再现性；以及（5）无论肿瘤周围组织的可用性如何的应用的可能性。

为了发展分级系统，比较了第1组和第2组之间的人口统计信息、肿瘤特征和组织学参数。使用方差分析和卡方/Fisher精确性检验来排除各组之间没有显著差异的参数。对于定量变量（肿瘤直径、有丝分裂计数），第1组和第2组之间的最佳临界值由受试者操作特征曲线确定。

将具有统计学显著P值的参数组合在各种算法中，并测试这些组合正确识别第2组猫的能力。进行二元逻辑回归以确认所选参数区分第1组和第2组肿瘤的能力。

通过Kaplan-Meier生存图研究分级方案的预后意义；对数秩检验用于比较低级别和高级别肿瘤之间的PFI和OS。通过多变量Cox回归分析比较分级系统与单独有丝分裂计数的预后实用性。

对于生存率分析，手术日期是切入点，即向实验室提交样本的日期。进一步发展为MCT相关疾病（PFI）或报告因MCT（OS）死亡的猫被记录为事件。剩下的猫被查到死亡日期（如果死于无关原因）或最后一次随访（如果没有死亡）。生存率估计值以中位数表示，具有相应的95%置信区间。

使用SPSS 24（IBM，Somers，NY）进行统计分析。显著性设定为P＜0.05。

这项研究中包括的63例猫科MCT的群体统计学、临床和组织病理学细节如补充表S1所示。

第1组

第1组共48例，代表品种有家养短毛(40只)、长毛(3只)、布娃娃(1只)、暹罗(1只)、波斯(1只)、缅因(1只)和夏特尔(1只)。雄性26例(54%)，雌性22例(46%)。平均年龄±SD为8.5±3.8岁。单发结节42例(88%)，剩余的猫有2个结节5例(10%)，有5个结节的1例(2%)。肿瘤位于头部30例(53%)，耳廓9例，眼皮6例，躯干20例(35%)，四肢7例(12%)。3个肿瘤(5%)位于狗的预后阴性的部位(手指2个，嘴唇1个)。最大结节的中位直径为1 cm(四分位数范围IQR为0.5~1.3 cm)。手术切缘干净39例(81%)，浸润性9例(19%)。在44例(92%)猫病例中，手术是唯一治疗方法，而4只猫接受了额外的治疗(皮质类固醇3例；托西尼布1例)

在数据分析结束时，34只猫(71%)存活，中位随访时间为1317天(IQR，1152-1531天)，而14只猫(29%)在中位OS 1412天(95%可信区间，1185-1939天)后死于与MCT无关的原因(慢性肾功能衰竭，6例；创伤性死亡，2例；鳞状细胞癌，2例；纤维肉瘤，1例；淋巴瘤，1例；胆管癌，1例；FIV，1例)。

在随访期内，5只猫(10%)肿瘤切除后局部复发(中位复发时间109天；95%可信区间9-324天)。3例被诊断为浸润性边缘，1例边缘干净。9只猫(19%)在远处发生了其他单个(6例)或多个(3例) cMCTs。在后一组中，2只猫形成2个单核细胞瘤，1只猫形成6个其他结节。中位PFI为252天(95%可信区间，30-520天)。

第2组

第2组包括15只猫，其中国内短毛猫11只，暹罗猫2只，土耳其安哥拉猫1只，夏特尔猫1只：雄性4只(27%)，雌性11只(73%)。平均年龄10.6±3.5岁。12只猫(80%)有一个结节，而3只(20%)有两个结节。肿瘤位于头部2例(11%)，躯干11例(61%)，四肢5例(28%)。3个肿瘤(17%)位于狗的腹股沟区域，预后为阴性。肿瘤平均直径2.5 cm(IQR 1.5~3 cm)。手术切缘良好者11例(73%)，浸润性者4例(27%)。

在3只猫(20%)中，确诊时有组织学证实的区域淋巴结转移。另2例(13%)在cMCT切除后95天和384天诊断为淋巴结转移。其中2只猫和另外6只猫(53%)在去除cMCT后的中位数141天后发展为皮肤播散型。9只猫(60%)--包括1只有淋巴结转移的猫，2只有皮肤播散型的猫，1只有两者兼有的猫--在切除cMCT的中位数340天后被诊断为脾MCT。另有8例患者(53%)接受了其他治疗，包括马西替尼(1例)、托西尼布(1例)、洛莫司汀(1例)、长春新碱(1例)和皮质类固醇(6例)。2只猫施行了脾切除术。5例进行淋巴清扫，4例进行皮肤结节切除术。中位PFI为95天(95%可信区间，1-262天)。14只猫因MCT死亡或被安乐死。在手术后2580天，只有1只患有皮肤播散性疾病的猫存活并处于临床症状缓解中。中位OS为349天(95%可信区间0~739)。

统计分析和评分系统

从背景资料分析，具有侵袭性生物学行为的肿瘤更有可能更大(P<.001)，并且很少位于头部(P=.00；表2)。在组织学参数中，与第二组肿瘤显著相关的参数包括皮下侵袭、核形状不规则、明显的核仁或染色质簇、存在固缩或核分裂、核分裂计数较高以及存在血管栓塞和淋巴聚集体。根据受试者工作特征曲线（ROC），肿瘤直径的最佳临界值为1.5 cm(敏感度80%；特异度80%；曲线下面积0.85；95%可信区间0.73-0.96；P < 0。01)，高倍视野中有丝分裂计数的最佳分界值为每10个细胞中有5个(敏感度为100%；特异度为79.17%；曲线下面积为0.92；95%CI为0.86~0.99；P<.001)。

根据这些结果，如果每10个高倍视野中有大于5个有丝分裂，并且至少有以下3个标准中的2个：肿瘤直径>1.5厘米，核形状不规则，核仁突起/染色质簇，则将肿瘤分类为高级别(图1-7；补充图S3-S6)。所有选定的参数都有统计学上显著的优势比，有利于高级别肿瘤的诊断(表3)。在存在多个cMCTs的9例(14%)病例中，来自同一猫的肿瘤形态相似，属于同一级别。

根据该分级系统，低级别肿瘤48例(76%)，高级别肿瘤15例(24%)。第1组有1例cMCT，第2组除1例外，其余均为高级别。值得注意的是，第二组中唯一的低级别cMCT属于研究结束时仍然活着的猫。

高级别cMCT患者的中位OS为349天(95%CI，0-739)，而低级别cMCT患者达不到(P<.001；图8)。在有丝分裂细胞计数的多变量分析模型中，分级系统是唯一保留预后意义的参数(风险比=47.05，95%可信区间=4.96-445.85，P=.001)

a缩写：DSH，国内短毛；HPF，高倍视野；IQR，四分位数范围。

除非另有说明，否则a值以n(%)表示。

b猫在手术后1000天内存活，没有感染与MCT相关的疾病。

c猫在肥大细胞肿瘤切除后出现淋巴结转移、内脏受累或皮肤播散性肥大细胞病。

d P<0.05。

e来自同一只猫的多个肿瘤纳入本研究(第1组57个肿瘤；第2组18个肿瘤)。

f腹股沟或肛周区域、乳房区域、皮肤粘膜连接、手指

图1-6。肥大细胞瘤，皮肤，猫。图1和图2：本研究中没有相关预后价值的组织学特征。图1.核大小不均。图2.多核。苏木精伊红(HE)。图3.淋巴细胞性浸润。在我们的病例中，这一特征在统计学上具有显著的预后价值，但由于缺乏特异性，未被包括在分级系统中。HE。图4-6。建议的分级系统中包含的组织学预后特征。图4.有丝分裂计数(箭头)。图5.突出的核仁或粗染色质簇。图6.核的多形性：肥大细胞核呈不规则的核形状(例如，明显的凹陷、多边形或节段性；箭头)。HE

图7.猫皮肤肥大细胞肿瘤分级系统的算法。尽管猫皮肤肥大细胞瘤由于发生率较低而未被纳入分级系统，但即使在没有其他组织学恶性特征的情况下，伴血管侵袭的猫皮肤肥大细胞瘤也应被认为是高级别的。HPF，高倍率视野。

缩写：HPF，高倍率视野。

a P<0.05。

图8 | 63只猫因皮肤肥大细胞肿瘤死亡的Kaplan-Meier生存曲线，根据建议的分级系统分层(P<.001)

关于猫MCT的几个问题在临床和病理层面仍然没有答案，包括如何识别值得进一步医学关注的病例。评估cMCT生物学行为的最大限制之一是缺乏标准化的分级程序，削弱了确认内脏受累和/或淋巴结转移的可能性。另一个限制是长期随访信息的连贯性很差，因此难以评估这些猫的实际死因。这可能源于这样一个假设，即几乎所有的猫科动物cMCTs在临床上都是良性的。事实上，手术切除后报告的全身扩散发生率高达22%，这与观察到的犬类转移率没有本质区别。

我们试图通过进行严格的筛选克服与分级和后续信息可靠性有关的困难，代价是减少病例数量和失去潜在意义的病例。事实上，对于与MCT无关的活着或死亡的猫病例，只有在能够随访特别长的时间(1003-3481天)时才包括在内，以排除恶性生物行为的可能性，即使在没有适当的临床监测的情况下也是如此，而所有死因不明的猫都被排除在分析之外。需要进一步研究，以便在更多的案例中测试目前的分级系统。

由于前述缺乏统一的分期程序，在9只出现脾MCT的猫中，我们不能完全排除去除cMCT时内脏受累。兽医文献对伴发的皮肤和内脏MCTs这一主题有不同的意见，在这些病例中应将其视为主要形式。然而，这项研究的目的是定义预后标准，以确定cMCTs可能与更广泛的疾病扩散相关，而不考虑皮肤病变的原发或转移性质。

提出的分级系统主要基于有丝分裂的数量，这是猫cMCT中公认的预后因素。这一参数被用来过滤分离潜在的高等级病例，以此来评估其他3个参数。所获得的分级系统，包括在多变量分析模型中的有丝分裂计数，是唯一保留预后意义的因素，表明与单独评估有丝分裂相比，该分级系统更有价值。

在分级系统中包括非组织学参数，如肿瘤直径，这一选择可能是有问题的。然而，这是客观的信息，病理学家一般可以从标本提交表格中获得。如果缺失，可以在组织学报告中添加注释，表明直径超过1.5厘米的肿瘤应被认为是高级别。

淋巴细胞性浸润性疾病、皮下侵袭、固缩/核破裂和瘤栓塞虽然在两组间有显著差异，但并不包括在分级系统中。尽管很容易识别，但淋巴细胞浸润物被认为不够特异，因为它在三分之一以上的低度恶性肿瘤中被检测到。淋巴细胞也与肿瘤组织类型明显相关，在多形性和非典型cMCT中报告的频率更高，并假设它们可能反映了对肿瘤的免疫反应。皮下侵袭的评估只有在完全提交给实验室的手术样本中才有可能。此外，在我们的猫cMCTs系列中，皮下浸润的存在很可能是由于结节增大所致。事实上，这项研究中几乎所有的肿瘤，包括那些属于第二组的肿瘤，都显示出致密的生长，和最小的浸润倾向。最后，肿瘤细胞坏死(固缩/核破裂)和瘤栓塞没有包括在分级系统中，因为它们在侵袭性肿瘤中出现的频率很低(分别为40%和27%)，导致这些参数的敏感性较差；此外，当样本缺乏足够的瘤周组织时，可能会漏掉栓塞。然而，即使在没有其他组织学恶性特征的情况下，有血管侵袭的猫cMCT也应该被认为是高级别的。

这项研究的局限性是非典型和多形性cMCT的数量很少，因此无法评估建议的分级系统在这些特定组织学亚型上的一致性。非典型和多形性亚型代表了猫cMCT的一小部分，其内在的预后意义仍有争议。非典型cMCT由边界不清的真皮深层或皮下组织细胞样肥大细胞混合淋巴聚集体和嗜酸性粒细胞组成。不典型的肥大细胞仅表现为模糊、不规则且多为正色的胞浆颗粒。据报道，这些肿瘤以多发性结节的形式出现在幼猫身上，特别是暹罗猫，它们与良性的临床病程或自发消退有关，类似于色素性荨麻疹。然而，非典型的cMCsT很可能被低估或误诊，因为它们的组织学类似于非肿瘤性混合性炎症过程(例如，嗜酸性肉芽肿)，需要免疫组织化学来鉴别猫进行性组织细胞增多症和其他肿瘤，包括黑色素瘤和皮肤淋巴瘤。因此，人们对它们的生物学行为知之甚少。

在本研究中，有6例不典型的CMCT：第1组4例，第2组2例，均为正确分级。虽然这表明非典型形态本身对预后并不重要，但该亚型中低数量的病例并不能对评级系统对的适用性作出结论。此外，非典型CMCT往往比肥大细胞性cMCTs大，而且核形状可能不规则；因此，从理论上讲，它们更有可能被划分为高级别。

猫多形性cMCTs的显著特征是单核或多核的肿瘤巨细胞比邻近的肿瘤细胞大3到20倍。在本研究中，第一组中只有1只猫被诊断为多形性cMCT，原因是少数细胞存在中度核大小不均(核直径最多变化3倍)。猫的多形性cMCTs有良性或恶性的不同报道，部分原因是最近在术语“多形性”和“弥漫性”之间的混淆。一个病例不足以推测；然而，根据这项研究，核大小不均本身不应被视为恶性特征。梅尔维尔等人最近的一项研究发现了一种新的罕见的猫cMCT亚型，具有分化良好的肥大细胞和显著的多核细胞，显示出更具侵袭性的行为。在目前的研究中，多核(即大于等于3个核)是一个相当常见的特征，在多达30%的肿瘤中观察到，但在第一组和第二组之间没有明显的分布差异。总的来说，这似乎阻碍了Kiupel犬MCTs分级系统应用于在猫MCTs。

有多个肿瘤的猫只有在所有结节都已被手术切除并可进行组织学检查的情况下才被纳入本研究，代价是消除了大多数可能是恶性肿瘤的多中心cMCT病例。然而，在9个包括多个结节的病例中，来自同一只猫的肿瘤具有相似的形态特征，并且分级相同，这表明在多个肿瘤的情况下，1个结节(可能是最大的)的组织学评估可能就足够了。

最后，建议的分级系统可以预测存活率，但不能预测PFI。必须注意的是，一些猫在一生中容易发生多个cMCTs，如果肿瘤切除不完全，可能会局部复发，而这并不一定是恶性肿瘤的迹象，我们的数据证实了这一点。显然，随着时间的推移，对每一个新出现的肿瘤进行分级是至关重要的，因为如果第一个cMCT是低级别的，那么后来出现的那些可能就不是。

总而言之，本研究提出了一种分级系统，该系统可以在提供可用的长期随访信息的63只猫的种群中识别大多数攻击性的cMCTs。这个系统依赖于有丝分裂的数量、肿瘤大小和核参数(核形状、核仁和染色质)。需要进一步的研究来证实它在不同猫种群上的预后作用，评估其重复性，并在更多的非典型和多形性亚型上测试它，这些亚型在本研究中没有得到充分的代表。