RNA G-四重体（RG4）是一种普遍存在的非规范二级结构，广泛存在于mRNA和非编码RNA中。它主要形成于富含鸟嘌呤的区域，在翻译调控、mRNA加工、选择性剪接、蛋白质结合和维持染色体末端完整性等方面发挥重要作用。RG4s比它们的DNA更稳定、更紧凑、含水量更低。核糖的2′羟基的存在增强了它们的形成和稳定性。RG4s的稳定性较少依赖于环境条件，这是由于其拓扑结构。研究RG4s对于理解RNA调控机制、推进生物医学、开发新药物和新疗法具有重要意义。这些结构可以用来精确控制细胞过程。RG4s在人类基因组的端粒和基因启动子中占有重要地位，调控基因转录、翻译、复制和基因组稳定性。它们也存在于病毒基因组中，比如寨卡病毒和埃博拉病毒，它们会影响病毒的生命周期和潜伏期。对RG4的研究为药物开发、生物材料和病毒治疗铺平了道路。RG4是一种独特的核酸工具，可以精确控制生物过程。
Cas12a，也被称为Cpf1，是一种在天然细菌免疫系统中发现的核酸酶。它具有顺式切割活性，能够在≈42 nt的CRISPR引导RNA （crRNA）的帮助下识别和切割目标DNA，该RNA由一个通用的直接重复（DR）区（≈19-21 nt）和一个可编程的间隔区（18-23 nt）组成。Cas12a通常用于基因编辑，因为它的脱靶率低，而且它能够仅与crRNA一起工作，而不需要反式激活CRISPR RNA （tracrRNA）。此外，活化的Cas12a具有反式裂解活性，可以消化非特异性单链DNA、RNA、δ DNA和3 '垂悬dsDNA，这使得Cas12a在传染病预防、早期癌症筛查、食品污染检测、法医检验和治疗药物监测等各种核酸快速检测领域的应用越来越广泛。
G4-PC-DR辅助CRISPR-Cas12a系统，旨在提高临床样品检测的灵敏度（图源自Advanced Science ）
准确控制Cas12a的活性对于精确的基因编辑和基因治疗至关重要，可以最大限度地减少脱靶效应。在核酸检测领域，由于等温扩增系统与CRISPR反应之间固有的不相容性，对Cas12a活性的精确控制变得更加迫切。在等温扩增的初始阶段，Cas12a的裂解活性可能会阻碍核酸扩增，特别是在输入拷贝数较低的情况下。最初版本的HOLMES和DETECTR需要单独的试管进行CRISPR反应和扩增，从而增加了诊断的复杂性，并可能产生由液体转移和气溶胶污染引起的假阳性结果。为了应对这些挑战，研究人员探索了各种优化策略，包括选择次优原间隔物邻近基序、物理隔离试剂、专用缓冲液和相分离解决方案。然而，传统的方法可能会阻碍CRISPR反应或在特定的临床样品测试中存在局限性，使相容性问题无法解决。
精确控制Cas12a的活性可以从根本上解决这些问题。研究人员对Cas12a的crRNA或其互补链进行了几种化学修饰。这些修饰暂时使CRISPR-Cas12a系统失活，随后在核酸扩增后通过暴露在紫外线下恢复。然而，以往的方法都需要引入化学修饰的核酸或用化学物质预先标记crRNA，从而使核酸检测过程复杂化，特别是在临床环境中。直接在crRNA中插入特定二级结构以直接控制Cas12a活性的潜力，可能会在临床核酸诊断中带来新的突破，这一领域存在知识空白。鉴于RG4在调节RNA转录和翻译方面的特殊特性，以及针对RG4的小分子药物和抗体正在进行的临床试验，研究建议在Cas12a的crRNA的5 '端引入RG4。RG4代表了一种独特的二级结构，它在不需要对crRNA进行化学修饰的情况下精确调节Cas12a活性。重要的是，crRNA和RG4的融合可以直接从DNA转录而不需要任何化学修饰。此外，可以利用钾离子或RG4稳定剂有效控制RG4的构象，实现对Cas12a活性的精准控制。
参考消息：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202411305
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