柱层析是抗体药物分离纯化的重头戏。层析是色层分析的简称，利用组分物理性质的不同，将多组份混合物进行分离及测定的方法。目前层析已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。不论属于哪一类层析，共同的特点是都具备两个相，不动的一相称为固定项，流过固定相的流体称为流动项。
层析起源:以碳酸钙作为吸附剂，利用石油醚将植物色素分离。
分离原理:植物色素分子具有性质差异，使得每种色素在层吸柱中的迁移速率不同。
层析分为两类，非吸附层析和吸附层析。非吸附层析包括凝胶过滤层析，吸附层析分为疏水相互作用层析，离子交换层析，亲和层析和反相层析。其中反相层析是小分子常用的层析技术，其余为生物大分子常用分离技术。根据分子的不同特性，选择适宜层析方法，以达到有效分离目标物质的目的，凝胶过滤层析根据大小区分，离子交换层析根据电荷区分，疏水相互作用层析根据疏水性区分，亲和层析根据生物识别的配基特异性进行区分。
1.凝胶过滤层析
凝胶过滤层析是根据分子的大小和形状的差异进行分离的一种简单可靠的层析技术。多孔的凝胶颗粒含有内孔，外孔和流动孔。比孔径小的分子进入孔道，延时流出。比孔径大的分子，不能进入孔道，直接流出，根据分子量的大小差异来实现区分。
分子流路长度:低分子量大＞中分子量大＞高分子量。
分子流出顺序:高分子量-中分子量-低分子量。
2.亲和层析
亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性识别并相互作用来分离纯化物质的层析方式。亲和层析的填料由三部分组成，基架，间隔臂和亲和配基。基架使配基附着在基架上，基架具有理化惰性。间隔臂，克服任何可能存在的空间位阻，改善配基和目标分子的结合。亲和配基，能够可逆地结合特定目标分子。亲和层析主要是一个吸附的层析，主要包括三个步骤，平衡，上样和清洗，洗脱。
平衡，首先通过缓冲液建立一种平衡的体系，让配基处于一种最佳的状态，更好地吸附目标蛋白。
上样和清洗，目标分子与配基可逆结合，未结合的配基的其他分子被冲洗下来。
洗脱，用洗脱缓冲液冲洗，将目标分子洗脱下来并收集。
3.离子交换层析
离子交换层析是通过生物分子所带的电荷与填料上所带的相反电荷的可逆相互作用来分离物质的一种层析方式。
蛋白质的表面净电荷:氨基酸是蛋白质的基本组成单位，不同的氨基酸具有不同带电性质的侧链，例如酸性氨基酸，碱性氨基酸和中性氨基酸。它们的表面净电荷具有高度的PH依赖性,随着周围环境PH的改变，他们的表面净电荷也会发生变化。
等电点PI是指一个分子不携带净电荷或在统计平均值中是电中性时的PH值。当分子溶液PH值小于分子的PI时，分子表面净电荷为正+，当分子溶液PH大于分子PI时，分子表面净电荷为-。结合分子所带的表面净电荷的差异，可以很好地实现产品和杂质的分离，这也是离子交换层析的原理。
根据填料的功能基团所带的电荷性质，可将离子交换层析分为阳离子交换层析和阴离子交换层析。阴离子交换层析吸附表面带负电荷的分子，阳离子交换层析吸附表面带正电荷的分子。
4.疏水层析
疏水层析是根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离物质的一种层析方法。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，不同的氨基酸具有不同疏水性质的侧链。在疏水层析中，通过高盐破坏蛋白质表面的水化层，暴露其疏水基团，进而使蛋白与疏水配基结合。低盐环境下通过建立水化层使疏水表面被隐藏，从而使目标分子与疏水配基脱离，目标分子被洗脱下来。
高度有序的水壳围绕着配体和蛋白质的疏水表面。高盐环境下，疏水物质被迫合并，以尽量减少这种壳的总面积（最大熵）。在疏水层析的疏水基团暴露结合的过程会有一些能量的变化，一般我们称为熵变的过程，温度对熵变过程影响比较大，因此在疏水层析过程中需要重点关注温度的控制。温度会影响疏水层析的层析图谱。
缓冲液中盐的存在会显著影响疏水蛋白和疏水层析介质的相互作用，高浓度的盐会增强相互作用，低浓度的盐会减弱相互作用。随着缓冲液中离子强度的降低，疏水相互作用发生逆转，具有最低疏水性的蛋白最先被洗脱，具有最强相互作用的蛋白最后被洗脱。
