成果简介
近日，山东大学生命科学学院王志彬副研究员在生态环境领域著名学术期刊Journal of Environmental Management上发表了题为“Surface immobilization and properties optimization of phage hydrolase against Gram-negative bacteria”的论文，采用分子克隆技术，构建含有柔性氨基酸肽链的表面固定化水解酶，提高了固定化水解酶的抗革兰氏阴性菌活性。通过硅亲和肽将水解酶固定在玻璃表面，并引入不同肽链，以此制备抗病原菌表面材料。与没有肽链的固定化酶相比，插入天然氨基酸肽链的固定化水解酶具有更高的杀菌活性、更好的稳定性和更持续的杀菌性能。其中，LysSSE1-NL-SiAP1表现最佳，经过三次杀菌周期后，仅使原始性能降低了约5%。建模分析表明，肽链的存在增加了近端水解酶结构域的分子灵活性，更好地与细菌底物相互作用。
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水解酶作为一种天然的生物物质，被认为在替代抗生素类药物、消除耐药细菌方面具有巨大潜力。与传统抗菌药物相比，它的环境友好性、对致病菌的高特异性，以及使细菌产生耐药性的可能性较低，使其成为杀菌和抑制细菌表面附着的潜在候选者。本研究采用分子生物学的方法，构建了含不同肽链的固定化水解酶：通过分子克隆的方法合成八个重组水解酶，并进一步将含有亲和配体的六个重组水解酶固定到玻璃表面；通过在不同温度、pH值、表面活性剂下的酶活测定，筛选出性能最优的固定化水解酶，并分析其所含肽链的性质特征；解析所获重组水解酶的二级、三级结构；为利用肽链进行蛋白质功能改造及水解酶在环境中的稳定应用提供数据支撑。
重组水解酶的表达纯化及杀菌活性研究
通过分子克隆技术，合成获得八种重组水解酶：LysSSE1-NL、LysSSE1-GSA、LysSSE1-SiAP1、LysSSE1-SiAP2、LysSSE1-NL-SiAP1、LysSSE1-NL-SiAP2、LysSSE1-GSA-SiAP1、LysSSE1-GSA-SiAP2，诱导之后通过SDS-PAGE和Western Blot分析它们的表达情况及分子大小，说明肽链的引入不会对目标蛋白的表达纯化产生影响。
将包含LysSSE1在内的所有水解酶均用于痢疾志贺菌1.1869的灭活（图1），发现LysSSE1和LysSSE1-NL表现出相似的和相对较高的活性，其次是LysSSE1-GSA，LysSSE1-SiAP1和LysSSE1-GSA-SiAP1。TEM和活死细胞染色表明所有水解酶均对细胞的胞膜结构造成破坏，导致细菌死亡。
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图1. 含不同肽链LysSSE1重组水解酶的抗痢疾志贺菌1.1869活性
通过亲和作用进一步将含有二氧化硅亲和配体的重组水解酶固定到玻璃表面，优化得到最佳固酶条件；进一步研究固定化水解酶的抗菌活性，分析不同柔性肽链和亲和配体对酶性能的影响，比较发现与不含肽链的固定化酶相比，肽链的插入有助于维持酶的杀菌活性，并且较长的NL链、较短的SiAP1链，更有助于融合蛋白的灵活性，表现出更高的固定化酶活性（图2a）；固定化酶的杀菌重复性存在较大差异，LysSSE1-NL-SiAP1具有最佳的可重复杀菌活性，在3个杀菌周期后仅降低了原始性能的5%左右（图2b）。LysSSE1-NL-SiAP2和LysSSE1-SiAP1在经过三个杀菌周期后，其活性分别降低了17%和20%；与游离酶相比，固定化有效地保持了酶在不同pH环境下的杀菌稳定性，即使在pH 9.1条件下也保持了大部分酶活；当温度升高到60℃后，所有固定化酶的活性均降低，其中LysSSE1-NL-SiAP2的活性损失最小，其次是LysSSE1-NL-SiAP1。
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图2. 固定在二氧化硅表面的水解酶的杀菌活性。a) 固定化水解酶的杀菌作用，b) 固定化水解酶的杀菌可重复性。
重组水解酶的结构预测分析
同源性建模可以看出（图3），该酶的结构域表现出相似的良好折叠结构，并且天然水解酶和几种重组水解酶之间的结构差异主要在于插入的氨基酸肽链。因此，所有重组水解酶的主要结构变异在于融合位点和添加的肽连接体，这也导致了每种酶的活性不同。
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图3. 通过同源建模预测的重组水解酶结构
虽然噬菌体水解酶在杀菌方面得到很多关注，但其在环境中的稳定性限制了它的应用范围。酶固定化可以解决这一问题。本研究采用氨基酸肽链，利用分子克隆的方法构建得到重组水解酶，并通过亲和作用将其固定化，所用材料均安全无污染。通过对固定化水解酶的杀菌活性和结构分析研究发现，肽链的长度会影响固定化水解酶性能，综合来说，NL链和SiAP1亲和配体二者表现最优。本研究可以为抗菌噬菌体水解酶表面固定化提供技术支撑，从而有效控制耐药菌的产生。
卢晗：山东省农科院助理研究员，在国内外期刊如Bioorganic Chemistry、Journal of Materials Chemistry B、BMC Microbiology、Virus Research、Applied Biochemistry and Biotechnology和Molecular Genetics and Genomics等发表26篇论文，主持山东省青年基金项目。
王志彬：山东大学副研究员，硕士研究生导师，广东省科技咨询专家，山东硅酸盐学会固废资源化专家委员会委员。主要从事微生物逆境适应相关研究。在Science Advances、Environmental Microbiology、Water Research等期刊上发表论文39篇，申请发明专利9项，主持国家自然科学基金、山东省青年基金、深圳市基础研究面上、山东省重大科技创新工程子课题等科研项目。
Han Lu, Sherif Ismail, Shou-Qing Ni, Zhi-Bin Wang, Surface immobilization and properties optimization of phage hydrolase against Gram-negative bacteria,Journal of Environmental Management, Volume 370,2024, 123029. https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2024.123029本期责编：刘乐乐 尹美淇
