iMetaOmics | 徐州医科大学朱作斌组-微生物对寿命的调节：机制和治疗策略

利用肠道微生物群延长寿命：机制和基因操纵的见解

●  探讨了肠道微生物群与宿主寿命之间的复杂关系，强调了微生物代谢物影响衰老途径的调节机制；

●  讨论了基于底物的干预措施，重点是微生物衍生化合物和工程益生菌，以对抗慢性炎症、神经退行性疾病和其他与年龄相关的疾病；

●  强调了通过宏基因组工程对肠道微生物群进行精确基因操纵的潜力，这是一种有前景的策略，可以促进健康衰老和治疗与年龄相关的疾病。

引  言

微生物与其宿主之间的复杂关系是多细胞生物许多生理过程的基础。宏观宿主由大量共生微生物组成。值得注意的是，成人体内细菌与人类细胞的比例约为1:1，当仅考虑有核人类细胞时，这一比例增加到约10:1，不包括无核红细胞。技术的进步大大提高了我们对宿主微生物组相互作用的理解，特别是那些涉及肠道微生物组的相互作用，肠道微生物组占共生微生物的95%。肠道微生物群在出生时就已经建立并不断进化，受到各种内部和外部因素的影响，如营养、生活方式、性别和生理学，导致个体异质性和在宿主中不同的功能。

最近的研究表明，肠道微生物群通过多种调节机制对宿主寿命产生影响。在百岁老人的肠道微生物群中观察到某些共性表明，肠道微生物群的特定组成与延长寿命有关。例如，虽然肠道微生物组组成在个体之间存在显著差异，但85岁以上个体的较高的拟杆菌丰度与4年随访中较低的存活率有关。此外，肠道微生物群与各种与年龄相关的疾病密切相关，其中许多疾病与肠道生态失调有关的疾病有着显著的相似之处。肠道生态失调是指肠道微生物群的不平衡，其特征是密度和组成的变化。尽管存在这些关联，但肠道微生物群调节宿主寿命的确切机制尚不清楚。本文重点阐述了与肠道微生物群相关的长寿调控途径，强调了微生物衍生物质在宿主信号通路复杂网络中的关键作用。

鉴于肠道微生物群与寿命之间的密切关系，操纵肠道微生物群成为促进健康衰老和延长寿命的一种有前景的策略。已经开发了许多基于微生物组的干预措施，包括益生元和合生元补充剂、粪便微生物群移植（FMT）和与健康相关的饮食方案，以促进健康。然而，尽管这些干预措施已经显示出一些健康益处，但它们在改变微生物组以促进健康和产生个性化有益反应方面的有效性往往有限，具体取决于个人的基线微生物组组成。因此，本综述不再仅仅关注传统的基于微生物组的干预措施，而是探索了更精确和有效的策略来缓解与年龄相关的疾病并延长寿命。这些策略基于细菌来源的底物和肠道微生物群的宏基因组工程。

肠道微生物调节宿主寿命的机制

衰老过程受到复杂的信号通路网络的调节，受到各种遗传和环境因素的影响。自从发现第一个长寿调控基因以来，已经鉴定出许多其他基因，每个基因都参与了复杂的衰老过程。一项综述提出了衰老的十二个标志，包括基因组不稳定、营养感知失调、线粒体功能障碍、慢性炎症、生态失调等。在这篇综述中，我们对肠道微生物调节宿主寿命的机制进行了分类，重点放在将肠道微生物群与寿命延长联系起来的关键信号通路上。

胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF)信号传导 (IIS) 通路

IIS通路是众所周知的寿命调节因子，调节生物体对压力、环境线索和营养物质可用性的反应。30多年前，在秀丽隐杆线虫中首次发现了这一途径，发现敲除胰岛素/IGF-1跨膜受体（IGFR）的同源基因DAF-2可以使寿命延长一倍。IIS通路在物种间是保守的，包括果蝇和小鼠，突显了其在衰老中的基本作用。此外，秀丽隐杆线虫DAF-16（human Forkhead box O（FOXO）蛋白的同源物）的肠道表达增加，通过促进DAF-16在其他组织中的表达和抑制IIS通路来延长寿命

肠道微生物群可以通过产生特定的代谢物来影响IIS途径。例如，秀丽隐杆线虫缺乏一氧化氮合酶（NOS）来产生一氧化氮（NO），但肠道细菌产生的NO能以依赖DAF-16和HSF-1的方式延长蠕虫的寿命。进一步的研究表明，枯草芽孢杆菌NCIB3610产生群体感应五肽能力孢子形成刺激因子（CSF）和NO，通过DAF-16依赖的IIS途径延长秀丽隐杆线虫的寿命。然而，由于遗传变异，并非所有枯草芽孢杆菌菌株都能产生CSF。同样，鼠李糖乳杆菌CNCM I-3690菌株通过促进DAF-16转录和增加抗氧化性，通过DAF-2/DAF-16依赖的IIS途径延长秀丽隐杆线虫的寿命，尽管确切的机制尚不清楚（图1）。

TOR 信号通路

雷帕霉素（TOR）的靶点是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节各种代谢过程中至关重要，包括蛋白质合成、葡萄糖代谢和线粒体功能。TOR存在于两种复合物中，TORC1和TORC2，对环境和激素信号都有反应，尤其是营养信号。TOR通路被认为是IIS通路下游的关键分子机制，特别是在饮食限制的情况下，这与寿命延长有关。TOR的抑制已被证明可以通过提高应激抵抗力、促进自噬、增强线粒体功能、抑制炎症和保护干细胞群来延长不同物种的寿命。最近对大肠杆菌K-12进行的全基因组筛查表明，细菌衍生代谢产物甲基乙二醛（MG）的减少通过抑制TORC2并随后激活DAF-16来延长宿主寿命（图1）。这突显了肠道微生物通过产生特定的代谢物在调节TOR信号传导影响宿主寿命的作用。

图1. 肠道微生物对寿命的调节机制

肠道微生物群通过复杂的信号网络影响宿主的寿命。关键途径包括胰岛素/IGF信号通路（IIS），其中肠源性代谢物如一氧化氮（NO）和群体感应五肽（CSF）与IGF受体（IGFR）直系DAF-2相互作用，调节PI3K/AKT/mTOR通路，影响营养感应和应激反应。TOR信号通路受细菌代谢产物甲基乙二醛（MG）的影响，MG抑制mTORC2，激活长寿促进因子，如人类FOXO蛋白的秀丽隐杆线虫同源物DAF-16。线粒体功能和生物发生由肠道微生物群通过colanic acid（CA）等代谢产物调节，后者诱导线粒体分裂并激活线粒体未折叠蛋白反应（UPR^mt），从而增强线粒体健康和寿命。应激反应途径由肠道衍生的小分子（如吲哚）调节，吲哚激活芳香烃受体（AHR）等受体，以维持ROS稳态并延长寿命。此外，包括MAPK和NF-κB在内的免疫途径受胆汁酸和细胞壁成分等微生物代谢产物的调节，控制慢性炎症并促进长寿。

线粒体通路

线粒体是衰老过程中不可或缺的一部分，线粒体功能障碍被认为是衰老的标志之一。研究表明，线粒体和细胞核在控制衰老方面存在复杂的相互作用。在衰老过程中，乙酰化水平的增加会使PGC-1α和HIF-1α等关键基因失活，这些基因对线粒体功能和生物合成至关重要，从而导致线粒体损伤。维持线粒体合成和线粒体吞噬之间的平衡对于维持细胞稳态和促进寿命至关重要。因此，线粒体功能的动态调节为延长寿命提供了一种有前景的方法。

最近的研究强调了线粒体应激反应，特别是线粒体未折叠蛋白反应（UPR^mt）在通过促进线粒体生物合成、功能和动力学来调节寿命方面的作用。此外，越来越多的证据支持肠道微生物群和宿主线粒体之间存在复杂的通讯网络。例如，肠杆菌素是一种主要由肠杆菌产生的铁载体，被吸收并运输到宿主线粒体中，在那里它与ATP合酶相互作用以调节宿主发育。

在另一项研究中，通过大肠杆菌K12的全基因组筛选发现了一种与UPR^mt相关的新的长寿促进机制。发现许多肠杆菌分泌的多糖colanic acid（CA）的过量产生在应激条件下诱导线粒体分裂并增强UPR^mt，从而延长宿主的寿命（图1）。这些发现表明，肠道微生物可以通过调节与线粒体及其代谢产物相关的特定信号通路来影响宿主寿命。

应激反应通路

抗逆性是调节生物体寿命的关键因素，使其能够应对各种环境和生理压力，如高温、紫外线照射、病原体和活性氧（ROS）。人们认为，亚致死暴露于这些压力源会激活保护性反应，从而延长寿命。例如，与未受应激的蠕虫相比，早期暴露于氧化应激的秀丽隐杆线虫对热休克的抵抗力更强，寿命更长。此外，关键的长寿相关通路，如IIS和哺乳动物TOR（mTOR）通路，调节hsf-1、jnk-1和skn-1等应激抗性基因的表达。

ROS不仅由线粒体电子传递链产生，还由外部因素通过NADPH氧化酶（NOX）和信号通路（如IIS通路）产生。虽然高水平的ROS会损伤蛋白质、DNA和细胞，但维持ROS稳态对生物体的生长和衰老至关重要。肠道微生物群可以显著影响ROS稳态和应激途径。例如，加氏乳杆菌菌株SBT2055（LG2055）的活性和非活性态都已被证明可以通过提高抗氧化防御系统的主要成分超氧化物歧化酶（SOD）的活性来维持低ROS水平，从而延长秀丽隐杆线虫的寿命。该菌株还上调了应激反应基因如skn-1、trx-1、clk-1和hsp-70的表达。同样，补充发酵乳杆菌菌株U-21分别通过增强对氧化应激的抵抗力和保护多巴胺能神经元，促进秀丽隐杆线虫和帕金森病小鼠模型的寿命。此外，研究发现，由大肠杆菌K-12变体产生的小分子吲哚可以通过保守的外源性小分子检测器芳香烃受体（AHR）增强线虫、黑腹果蝇和小鼠的抗逆性、寿命和繁殖期（图1）。这些发现表明，益生菌补充和其他微生物干预可能是维持ROS稳态和促进健康衰老的有前景的策略。

免疫通路

免疫反应是一种复杂的机制，可以保护宿主免受各种病原体的侵害，同时在炎症和组织修复中也起着至关重要的作用。然而，尽管它在清除病原体方面有好处，但慢性免疫激活和炎症（通常称为“炎症”）可能会导致衰老过程和与衰老相关的疾病。因此，免疫力是调节寿命的重要因素，较弱的免疫防御已被确定为衰老的标志。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在真核生物中是保守的，是免疫反应和炎症的核心。慢性炎症与衰老和与年龄相关的疾病有关，可能在生物体的整个生命周期内持续存在，影响健康生活。

肠道共生微生物群可以通过对免疫反应的影响来调节宿主的寿命。一个直接的例子是口服产生SOD和过氧化氢酶（CAT）的重组乳酸菌（LAB）大肠杆菌Nissle 1917（ECN）。这种干预已被证明可以抑制由结肠右旋糖酐硫酸钠（DSS）、2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）和恶唑酮等药物诱导的胃肠道炎症，从而可能延长寿命。此外，已知的益生菌乳酸双歧杆菌菌株LKM512已被证明可以抑制慢性炎症，保持肠道屏障的完整性，并通过增加肠道多胺（PA）的浓度来延长哺乳动物的寿命。而多胺在细胞生长和功能中起着重要作用，这对维持肠道健康和寿命至关重要。

肠道中另一种重要的微生物代谢产物是胆汁酸（BAs），据报道，胆汁酸在衰老过程中起着至关重要的作用。一项涉及160名百岁老人的研究发现，这些人有一个独特的肠道微生物群，其中富含能够产生独特次级BA的微生物。BA通过两个主要机制发挥抗衰老作用：直接对抗病原体和调节免疫反应。一方面，BA对革兰氏阳性病原体（包括多重耐药菌株）具有强大的抗菌作用，并在维持肠道屏障完整性和减少炎症方面发挥着重要作用。另一方面，BA充当信号分子，通过核和膜受体激活免疫途径，如武田G蛋白受体5（TGR5）和孕烷X受体（PXR），也称为类固醇和外源性传感受体。BAs激活TGR5可以通过ERK1/2和mTOR触发MAPK信号传导，导致细胞因子转录和巨噬细胞迁移减少。另一方面，PXR激活控制BA池大小和组成的反馈调节途径，这对免疫调节至关重要。例如，PXR的缺失导致BA库减少，尤其是胆酸，如前所述，胆酸转化为石胆酸并参与免疫反应。有趣的是，合成配体激活PXR已被证明可以通过与基因启动子中的NF-κB结合位点结合来抑制炎症基因如白细胞介素-1β（IL1B）和一氧化氮合酶2（NOS2）的转录。

此外，细菌细胞壁成分可以激活宿主的免疫反应并调节寿命。例如，长双歧杆菌（B. longum）菌株BB68和婴儿双歧杆菌（B. infantis）的细胞壁成分已被报道通过p38 MAPK途径延长秀丽隐杆线虫的宿主寿命。另一个值得注意的发现是，免疫刺激细菌丰度的减少可以保护小鼠免受C9ORF72突变和全身炎症引起的神经退行性疾病的侵害，这进一步证明肠道微生物会影响炎症和寿命。

这些例子说明了肠道微生物群及其代谢产物对免疫系统和整体寿命的深远影响，强调了微生物群靶向疗法在促进健康衰老方面的潜力。

基于细菌衍生物的干预措施治疗与年龄相关的疾病

图2. 基于基质的干预措施治疗与年龄相关的疾病

肠道微生物群及其来源的底物在影响年龄相关疾病方面发挥着关键作用，包括慢性炎症、神经退行性疾病和癌症。该示意图强调了微生物衍生化合物，如可乐酸（CA）、吲哚和多胺（PA），对肠道屏障的完整性及其减少慢性炎症的能力的有益影响。设计用于调节细胞外ATP（eATP）水平的工程益生菌已被证明可以改善炎症性肠病（IBD）。此外，还描述了将肠道微生物群与神经退行性疾病联系起来的两种机制：（1）乳杆菌科的肠道微生物群产生异戊胺（IAA），这会增加小胶质细胞凋亡，导致认知能力下降；（2）高盐饮食会减少丁单胞菌病毒的丰度，通过PI3K-Akt途径损害突触功能。

鉴于肠道微生物群在长寿中的关键作用以及治疗与年龄相关疾病的巨大临床潜力，必须进一步了解肠道微生物调节宿主寿命和健康的精确机制。这种理解将为旨在促进健康老龄化的更有针对性和有效的干预措施铺平道路。

肠道微生物群的宏基因组工程：操纵肠道微生物遗传变异以延长宿主寿命

肠道微生物组内的遗传变异是影响宿主寿命的关键因素。这种变异是生物系统内自然选择和多样性的基础。在哺乳动物中，肠道微生物组不仅是可遗传的，而且对饮食、药物和生活方式等环境因素高度敏感。这些环境影响可以驱动微生物组的改变，导致获得新的特征，如抗生素抗性、毒力或产生促进宿主寿命的物质的能力。肠道微生物群的适应性意味着，对宿主有益的遗传变异更有可能繁殖和保留。

尽管许多研究探索了微生物组组成（特别是物种和菌株多样性）与宿主寿命之间的关系，但对这些微生物内部遗传变异的影响关注较少。随着更多有益肠道微生物促进健康和延长寿命的机制被发现，来自微生物组的特定酶和底物已被确定为肠道微生物群与宿主相互作用的关键因素。与对物种和菌株多样性的广泛操纵相比，针对影响这些有益化合物生产的遗传变异可能提供一种更有效、更精确的方法来促进长寿（图2）。

图3. 肠道微生物群在衰老中的作用和基因操纵潜力概述

肠道微生物群与衰老之间的关系是复杂的，对健康和疾病都有重大影响。肠道生态失调是一种微生物组成失衡，与不健康的衰老有关，其特征是慢性炎症和神经退行性疾病的风险增加。从消极的一面来看，生态失调通过扰乱正常的生理过程，特别是与免疫和神经功能相关的生理过程来促进与年龄相关的疾病发生。相比之下，平衡的肠道微生物群起着保护作用，促进健康衰老和抵抗与年龄相关的疾病。这种平衡的一个关键因素是脑肠轴，它促进了肠道和中枢神经系统之间的双向交流，影响了认知健康和整体生理衰老。肠道微生物群基因操纵的进展为纠正生态失调提供了潜在的干预措施，使微生物群能够支持长寿并降低与衰老相关的风险。通过针对特定的微生物种群或代谢产物，这些策略旨在恢复更健康的微生物群，从而促进健康衰老，减轻与年龄相关的疾病的影响。

图4. MAGIC (原位接合改变肠道微生物组宏基因组)

MAGIC是一个平台，旨在通过水平基因转移直接在肠道微生物群的原生环境中对其进行基因改造。它利用工程大肠杆菌菌株作为供体细菌，将复制或整合的遗传有效载荷转移到肠道微生物组中的不同微生物受体中。在顶部面板中，供体细菌包含一个复制载体，由复制起点（OriR）、一个稳定的遗传盒和结合机制（tra）标记。接合过程使复制载体能够从供体转移到受体细菌，在那里遗传物质独立复制，从而允许引入的基因在受体群体中稳定表达。在底部面板中，供体细菌携带带有转座酶（Himar Tnase）的整合遗传载体，这有助于将所需的遗传有效载荷整合到受体的染色体中。

B. 噬菌体递送 CRISPR-Cas9系统

噬菌体递送的CRISPR-Cas9是一种利用工程噬菌体将CRISPR-Cas 9系统递送到肠道微生物组内特定菌株的技术。这种方法利用丝状噬菌体，如M13，可以将遗传物质转移到细菌身上，而不会引起细胞裂解。通过将CRISPR-Cas9系统整合到噬菌体中，研究人员可以靶向并诱导肠道内细菌种群的菌株特异性耗竭或基因组缺失。该系统能够进行精确的基因编辑，允许去除或修改特定的细菌菌株或基因（图5）。它为微生物组操纵提供了几个优势，特别是在复杂的微生物群落（如肠道）中实现菌株特异性靶向和基因编辑。其精确度允许在不影响更广泛的微生物组的情况下对特定细菌菌株进行耗竭或基因组修饰，使其成为研究细菌功能或开发治疗干预措施的有力工具。此外，它可以在不引入外源细菌的情况下使用，这在其他微生物组编辑技术中可能具有挑战性。然而，这种方法也有一些局限性。一个主要的挑战是细菌逃避CRISPR-Cas9靶向的可能性，通过丢失CRISPR阵列或靶位点的突变可能会导致不完全耗竭。此外，由于胃肠道转运过程中噬菌体存活或需要抗生素选择以维持基因修饰等因素，噬菌体体内递送的效率可能会受到限制，这可能会破坏微生物组。总体而言，虽然噬菌体递送的CRISPR-Cas9是一种有前景的技术，但需要进一步优化以提高靶向效率并克服细菌逃逸机制。

图5. 噬菌体递送 CRISPR-Cas9系统和INTEGRATE (通过引导RNA辅助靶向插入可转位元件)

该图展示了两种互补的基因组编辑技术：噬菌体递送的CRISPR-Cas9和INTEGRATE。噬菌体递送的CRISPR-Cas9（左图）利用工程丝状噬菌体，如M13，将CRISPR-Cas 9系统引入肠道微生物组内的特定细菌菌株，靶向并诱导细菌基因组中的序列特异性双链断裂（DSBs），导致菌株特异性耗竭或基因组缺失。INTEGRATE（右图）是一个基于CRISPR的系统，旨在通过转座因子将千碱基大小的DNA序列精确插入细菌基因组。该系统使用CRISPR Cascade复合物将TniQ和转座酶复合物（TnsA、TnsB、TnsC）引导到特定的基因组位点，允许插入供体DNA，而不需要DSB或同源重组。

C. INTEGRATE (Insertion of Transposable Elements by Guide RNA-assisted Targeting，通过引导RNA辅助靶向插入可转位元件)

INTEGRATE是一种基于CRISPR的系统，能够高效、精确地将千碱基大小的DNA序列插入细菌基因组。该系统利用CRISPR-Cas机制将转座子引导到特定的基因组位置进行整合，而不需要双链断裂（DSB）或同源重组（HR）。INTEGRATE利用置换蛋白，如TnsA、TnsB和TnsC，以及RNA引导的DNA靶向复合物（TniQ Cascade），在细菌中实现可编程和无标记的基因组整合，效率约为100%（图5）。INTEGRATE在细菌基因组工程中具有几个优势，特别是它能够实现高效、精确和可编程的大段DNA序列插入，而不需要DSB或HR。该系统允许在特定的基因组位点无缝、无标记地整合多达10千碱基的DNA，通过使用具有多个引导RNA的CRISPR阵列，在多重基因插入中提供高保真度和灵活性。另一个关键优势是其广泛的宿主范围活性，使其在不同的细菌物种和复杂的微生物群中都有用。此外，INTEGRATE避免了与DSB相关的细胞毒性作用，即使在非模型生物中也能提供快速、高效的插入。然而，INTEGRATE有一些局限性。它无法实现无瘢痕编辑或点突变，这需要其他基因编辑技术。此外，它对转座子末端序列的依赖可能会引入序列约束，并且该系统可能不太适合需要精确控制较小或功能序列插入的应用。

合适的利用这些基于微生物组的尖端遗传技术具有巨大的潜力，可以彻底改变与年龄相关的疾病的治疗。通过利用这些费用，我们可以在促进健康老龄化方面取得突破，最终提高生活质量并延长寿命。

总  结

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！