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1.本研究以巨噬细胞为主要研究方向，并通过代谢应激+免疫细胞浸润+富集分析+差异基因表达等分析，探究了代谢紊乱对心脏巨噬细胞浸润的影响，内容充实且创新性强，是文章质量的关键！
2. 本研究通过单细胞测序+动物实验，揭示了模型中代谢应激依赖性心脏巨噬细胞的激活，瞬间秀翻全场！是文章拿高分的关键，质量稳稳滴！文章干湿结合轻松拿下35+的高分！思路简直无敌了，高分手到擒来！（ps：听完小记者的介绍，小伙伴们是不是瞬间信心倍增？单细胞测序+代谢应激+巨噬细胞就是杠杠滴厉害! 如果你有思路，不知怎么复现，赶紧关注小记者吧! 小记者这里有超多高分思路与新的分析方向，快来和小记者一起学习吧! 下一个拿高分的就是你!）
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题目： 单细胞RNA测序揭示了血脂异常诱导舒张功能障碍模型中代谢应激依赖性心脏巨噬细胞的激活
杂志：Circulation
影响因子：IF=35.5
发表时间：2024年11月
公众号回复“999”领取原文PDF，文献编号：241113
研究背景
代谢紊乱通常与射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）相关，这是一种治疗挑战。代谢诱导的全身性炎症与HFpEF的合并症有关。然而在HFpEF的情况下，代谢变化如何影响心肌炎症尚不清楚。
研究思路
本研究通过单细胞RNA测序分析CD45+心肌细胞的表达，以评估炎症在舒张功能障碍中的作用。本研究分析代谢紊乱对心脏巨噬细胞浸润的影响，并鉴定巨噬细胞到心肌细胞的调节轴。为了测试临床相关的达格列净是否可以改善模型中心脏免疫浸润情况，本研究让小鼠随机接受达格列净或对照药8周。
主要结果
1.代谢应激诱导的HFpEF小鼠模型
由于ApoE KO- wd小鼠显示出几种与HFpEF相关的合并症，包括代谢功能障碍，本研究分析了ApoE KO小鼠在喂食这种类型的饮食时是否也会发生HFpEF（图1A）。超声心动图分析显示，只有ApoE KO小鼠逐渐发生同心性心脏重构 (图1B)。尽管所有实验组均保留了收缩功能(图1C)， WD 7周和12周后，只有ApoE KO-WD小鼠舒张功能受损(图1D)，同时舒张压末期明显升高(图1E)。ApoE KO-WD小鼠也出现运动不耐受(图1F)，肺重量明显增加，提示肺充血(图1G)。此外，ApoE KO-WD小鼠冠状动脉血流储备减少，但冠状动脉基底血流没有改变(图1H)，提示内皮功能受损。
图1 饲喂WD的ApoE KO小鼠表现出HFpEF的主要特征
2. 单细胞测序技术表征HFpEF患者心脏免疫细胞亚群
为了进一步剖析HFpEF模型中的炎症特征，本研究对心脏CD45+细胞进行了单细胞测序。本研究得到21 171个细胞，无监督Seurat聚类鉴定出4种情况下的15个CD45+细胞簇(图2A)。基于细胞特异性标记基因的表达(图2B)，本研究确定了存在的主要免疫细胞类型。在6个确定的簇中，巨噬细胞是最丰富的亚群（图2C）。本研究根据先前描述的亚群对细胞进行分组，其相对丰度与先前观察到的相似（图2D）。最丰富的亚群是：Timd4+细胞，其表达高水平的Timd4和Lyve1 (图2 E)。本研究对特定的标记基因进行聚类分析，研究发现Tim4+亚群富集了已知具有抗炎特性的核受体信号通路，并且干扰素信号通路仅与干扰素激活的巨噬细胞相关（图2F）。
图2 WT和ApoE - KO小鼠免疫浸润的高维单细胞谱分析
3. scRNA-seq数据集差异基因表达分析揭示代谢应激对巨噬细胞的影响
为了确定疾病进展过程中巨噬细胞的转录动力学，本研究使用Monocle 3构建了单细胞伪时间轨迹（图3A）。伪时间顺序通过许多不同的转录状态向病理状态发展（图3B）。随后，本研究计算了共调控基因的模块。在模块2中，神经炎症信号通路、TREM1信号通路、TNF-α、IL-6和IL-1细胞因子介导的信号通路以及t细胞活化和凋亡是富集最多的信号通路（图3C）。为了进一步探讨基因型、饮食和这两个参数联合对巨噬细胞转录谱的影响，本研究进行了差异分析（图3E）。接下来，本研究使用SCENIC算法来识别与转录变化有关的上游转录因子（TFs）。研究发现，有几个因子参与调节未折叠蛋白反应的3个分支：IRE1/XBP1， PERK/ ATF4和ATF626（图3F）。延长内质网应激最终证实了内在和外在凋亡通路在HFpEF条件下的激活（图3G）。ps：单细胞分析数据处理量很大，用上服务器事半功倍！小记者这里提供生信服务器，共享/独享皆可，一对一辅助指导，咨询小记者还可免费试用哦
图3 代谢应激对巨噬细胞的双击效应
4. 代谢应激相关HFpEF的心脏meta炎症
接下来，本研究探究血脂异常是否与心脏代谢的特定改变有关，是否反过来又会促进促炎环境。研究发现，ApoE KO-WD组共有44%的代谢物被特异性调节，其中大部分来自脂质途径（图4A和4B）。虽然饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸水平在WT和ApoE KO小鼠中增加的程度相似，但WD与ApoE KO小鼠左心室不饱和脂肪酸的显著减少，与中链和长链酰基肉碱的增加有关（图4C和4D）。在调节最高的代谢物中， C12和C14及其酰基肉碱衍生物在ApoE KO WD小鼠的LV中显著增加(图4E)。为了测试这些饱和脂肪酸是否能促进巨噬细胞的促炎激活，本研究从WT和ApoE KO小鼠中获得骨髓来源的巨噬细胞，并将它们单独暴露于月桂酸盐、肉豆蔻酸盐或两者的组合中（图4F）。暴露于脂肪酸导致几种与HFpEF条件独特相关的促炎介质的表达显著增加（图4G）。
图4 ApoE KO和WT小鼠心脏组织代谢组学分析
5. 细胞间通讯识别巨噬细胞到心肌细胞的调节轴
HFpEF的其他特征是心肌肥厚和心肌细胞收缩改变。ApoE KO-WD小鼠表现出明显程度的心肌肥厚（图5A），体外心肌细胞收缩能力评估显示，ApoE KO-WD小鼠左心室心肌细胞松弛受损（图5B）。从小鼠心脏中分离心肌细胞并进行大量RNA测序。在心肌细胞中发现的356个基因，预计有57个是巨噬细胞分泌配体的靶标(图5C和5D)。在巨噬细胞-心肌细胞通讯轴的界面上发现的靶点在多种心脏应激途径中富集，如肥大、纤维化和自噬，以及WNT/β-catenin信号传导（图5E）。并且，新生大鼠心肌细胞暴露于TNF-α、IL-6、IL-15或三者的组合，显著诱导了几种预测靶基因的表达，包括Irf1、Angptl4、Fos和Cpt1b(图5F)。
图5 巨噬细胞-心肌细胞通讯的NicheNet分析
6. 达格列净可钝化代谢应激相关HFpEF的心肌炎症
为了检验SGLT2i是否能改善心脏免疫浸润情况，本研究将被喂食WD 7周并出现舒张功能障碍的ApoE KO小鼠随机喂食SGLT2i达格列净或对照药8周，然后通过超声心动图进行评估（图6A）。在HFpEF条件下，达格列净改善了心肌肥厚的各项参数和舒张功能不全(图6B)，无收缩功能改变(图6C)，肺充血减少（图6D）。值得注意的是，达格列净治疗增加了心脏中巨噬细胞的丰度，导致心脏停留的Timd4+巨噬细胞的相对丰度完全恢复（图6E）。在ApoE KO-CD和WD小鼠心脏分离的常驻Ccr2 -巨噬细胞中，达格列净分别显著调节104个和276个基因的表达(图6Ff)。途径富集分析显示，在受达格列净抑制的通路中，有几个参与炎症激活和细胞应激反应（图6G）。
图6 达格列净改善心功能，逆转炎症活化
文章小结
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