中医药方向的研究现在真是太火了，还有国家大力扶持，发文量暴涨啊！其中，风头最盛的当属“网络药理学”，小记者今天就发现了一个内容超级丰富的网药文章，算是看过这么多网药文中的天花板思路了，研究团队可真够下本的，工作量足足的，发到1区7分+都低了！buff到底有多少，跟着小记者一起俩挖挖看吧！
这篇文章由济宁市第一人民医院团队发表，发到了1区7.7分的生信友好刊（IJBM）上。
1. 疾病选择的是乳腺癌，网药更多是研究非肿瘤疾病，选肿瘤的话可以避开主阵地，竞争小，创新性也高；
2. 文章思路设计为网药+分子对接+分子动力学模拟+MR分析+单细胞分析+代谢组学+实验，热点分析多维度整合，内容非常丰富，逻辑完整，创新性很高，但单个分析的难度并不是很大，可以参考思路复制一篇，拿去冲击高分很好用！
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题目：JNK蛋白在小白菊内酯抗乳腺癌疗效中的关键作用:来自网络药理学、单细胞RNA测序和代谢组学的新的综合证据
杂志：IJBM（IF=7.7）
发表日期：2024年11月
公众号回复“999”领取原文PDF，文献编号：241114
研究背景
小白菊内酯(PTL)，一种最初提取自银胶菊，天然存在的倍半萜内酯，已经对其抗炎、氧化还原调节和表观遗传活性以及针对肿瘤干细胞和祖细胞的选择性细胞毒性进行了高度研究。PTL也具有多靶点和多通道调节药理学特征，这使得用传统的单靶点药理学模型完全阐明PTL在乳腺癌（BC）治疗中的作用极具挑战性。因此迫切需要使用网络药理学、scRNA-seq和代谢组学的综合模型来阐明PTL治疗BC疗效的药理学机制。
研究思路
通过网络药理学确定核心靶点、关键生物学过程和对BC治疗至关重要的主要信号通路。利用ssGSEA分析探索核心靶点和浸润性免疫细胞之间的相关性，MR分析评估代表性核心靶点和BC之间的因果关系。分子对接和分子动力学模拟初步评估了核心靶点和PTL之间的相互作用，随后通过MST和SPR分析进行了验证。利用单细胞数据分析了主要受PTL影响的细胞类型。通过体内外实验验证生信结果，最后通过代谢组学检测PTL治疗组和对照组之间的差异代谢谱，阐明与PTL治疗效果相关的代谢途径。
主要结果
1. PTL治疗BC的靶点鉴定和分析
从PharmMapper数据库中获得346个PTL相关靶点。从 GeneCards数据库中获得了879个BC相关的疾病靶标。对GEO中的BC数据集进行差异分析得到679个DEGs，WGCNA分析得到1221个与 BC 密切相关的模块基因，两者取交集得到485 个交叉 基因，再进行 LASSO 回归分析筛选到24个基因。将这24个基因与879个BC靶点合并去重，最终得到902个BC相关基因（图1）。将 902 个疾病靶标与 346 个药物靶标取交集，获得70个重叠靶点，作为PTL治疗BC的靶点。PPI网络分析识别到16个核心治疗靶点（图2）。然后针对治疗靶标进行GO和KEGG富集分析，GO富集分析显示基因主要富集于神经胶质细胞增殖的正向调节、氧化应激诱导的内在凋亡信号传导途径的负向调节、活性氧物质代谢过程的调节、免疫调节等过程。KEGG分析显示显著富集的途径分别是 MAPK 信号途径、乳腺癌、癌症中的蛋白聚糖、脂质和动脉粥样硬化以及 FoxO 信号途径（图3）。
图1：PTL和BC相关靶点的获得
图2：PTL治疗BC的靶点鉴定和分析
图3：GO和KEGG分析
2. 免疫浸润分析
首先利用 ssGSEA 算法分析了 GSE139038 和 GSE205185 数据集的免疫浸润景观，然后研究了核心治疗靶点与 28种免疫细胞的相关性。结果显示，在对照组和 BC 组之间，大多数免疫细胞的相对比例存在显著差异。核心靶点基因 AKT1、PGR、MMP9、MAPK1 和 HSP90AA1 显示出与浸润的免疫细胞更强的相关性，并且T细胞与更多的核心治疗靶点相关，表明 T 细胞可能在PTL治疗BC的免疫调节中占据中心地位（图4）。
图4：免疫浸润分析
3. 单细胞分析
基于GSE118389 中的 scRNA-seq 数据进行单细胞分析，根据细胞标记基因注释为 8 种不同的细胞类型。对标记基因进行KEGG分析显示了BC 疾病的巨大异质性。细胞通讯分析发现 8 个细胞亚群之间存在非常密切的关系和双向串扰。药物靶向AUCell 功能评分的细胞分布表明，PTL 主要影响上皮细胞、单核细胞和T细胞。最后分析了BC细胞中前6个关键治疗靶点的细胞分布和表达模式（图5）。ps：单细胞分析数据处理量太大？推荐用服务器！生信日报提供服务器租赁服务，想要免费试用直接联系小记者，还有超多优惠等你来询
图5：单细胞分析
4. 结合亲和力分析
首先使用 AutoDockTools 评估了PTL与16个核心治疗靶点的结合亲和力。结果显示PTL 与 16 个核心靶的计算结合能接近甚至低于-7，表明它们具有良好的结合作用，其中PTL 与 JNK 蛋白(MAPK8)的结合能力最强。随后通过分子动力学模拟研究运动中PTL 与 JNK 蛋白的相互作用。为了进一步研究 PTL和JNK蛋白之间的直接相互作用，进行了MST和SPR分析，结果显示PTL 直接与 JNK 蛋白相互作用（图6）。
图6：结合亲和力分析
5. MR分析
鉴于 JNK 被认为在PTL治疗BC的过程中发挥了关键作用，所以作者用 MR 分析来 分析JNK和 BC之间的因果关系。IVW 分析显示，JNK 与乳腺癌有因果关系，并且是 乳腺癌的危险因素。敏感性分析证明了这一结果的稳健性（图7）。
图7：MR分析
6. 实验验证
作者利用体内外实验检测了PTL的抗癌作用以及作用机制。体外实验结果显示，PTL 抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡（图8），PTL增强了细胞内 ROS 的生成并进一步激活了 ROS/JNK 信号轴（图9，图10），PTL诱导FoxO1 介导的内源性凋亡途径激活（图11），JNK 是 PTL 启动凋亡途径的关键上游调节剂（图12）。体内实验发现，PTL 降低了 BC 异种移植模型中的肿瘤重量和大小，降低肿瘤组织中 SOD 活性，增加 MDA 含量，促进体内 T 淋巴细胞的免疫浸润（图13）。
图8：PTL 对 SUM-159 细胞增殖和凋亡的影响
图9：PTL 对活性氧生成的影响
图10：PTL治疗激活了JNK信号
图11：PTL 治疗激活内源性凋亡信号通路
图12：JNK 是 PTL 诱导细胞凋亡的关键介质
图13：PTL 在 4T1 异种移植 BC 模型中的抗癌活性
7. 非靶向代谢组学分析
通过代谢组学检测PTL治疗组和对照组之间的差异代谢谱，阐明与PTL治疗效果相关的代谢途径。结果显示，在正离子模式和负离子模式中分别鉴定出 16 和 17 种代谢物（图14）。在 PTL 处理后，在正离子模式中确定了 14 种上调的代谢物，2 种下调代谢物。负离子模式下，PTL处理后10种代谢物上调，7种代谢物下调。差异代谢物中，属于“脂质和脂质样分子”类别的差异代谢物的丰度最高。KEGG代谢途径富集分析显示，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、癌症中的胆碱代谢和不饱和脂肪酸的生物合成途径显著富集（图15）。
图14：差异代谢物鉴定
图15：差异代谢物分析
小结
这篇文章思路真的是太太太丰富了，思路设计创新性较高，工作量很大，非常适合冲击高分！网药内卷形势下，就需要用这种联合创新思路去求突破冲高分，文中的单个分析并不复杂，比较容易模仿复现，想做高质量高分中药生信的朋友建议参考这种思路，换个疾病还能再发一篇。想要在中医药领域追求创新思路的朋友，建议紧跟小记者脚步，生信热点日更不停！想做个性化生信分析？欢迎随时联系小记者！专业团队为你保驾护航，1V1定制创新思路~另外，想自学网药药理学分析的宝子可以点击下方链接进行线上视频课学习，随到随学！
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