基于细胞外囊泡（EV）的治疗方法在药物递送、免疫治疗和再生医学中备受关注。然而，EV的临床转化因产量有限、功能异质性及靶向性不足而受阻。通过改造EV的固有功能并赋予其额外功能，有望加速其临床应用。生物正交点击化学因其在不破坏EV内在结构的前提下，能以可控且特异的方式对其进行修饰，受到广泛关注。2022年诺贝尔化学奖再次凸显了该技术的优势。目前，已有一些文献展示了生物正交标记在EV的分离、成像和治疗中的巨大潜力。
近日，南京工业大学刘冠楠团队在Trends in Pharmacological Sciences杂志上发表题为“Engineering extracellular vesicles for diagnosis and therapy”的综述论文（2024 Oct;45(10):931-940）。主要介绍了基于生物正交点击化学工程化改造细胞外膜囊泡的最新进展，概述了工程化外膜囊泡的标记策略及其优势，讨论了其在分离纯化、诊断和治疗中的应用，尤其强调生物正交糖代谢工程囊泡在体内靶向治疗中的应用。文章还对细胞外膜囊泡工程技术的发展前景进行了展望。第一作者费正月，通讯作者为南京工业大学刘冠楠，任浩和南京医科大学第一附属医院郑翔翔。
基于EV的治疗方法在药物递送、免疫治疗和再生医学领域引起了极大的关注。为了克服限制囊泡临床转化的问题，对囊泡进行改造是有必要的。然而，常用的方法如离心、超声波、基因工程，存在着耗时，损害EV结构等问题。生物正交点击化学在EV工程中具有独特的优势，尤其是无铜点击化学，主要包括张力促进的叠氮-炔基环加成反应(SPAAC)和逆电子需求的Diels-Alder反应(iEDDA)，避免了金属催化剂的潜在毒性。这种创新的方法具有可控制性、特异性和靶向性，能够快速反应，并最大限度地减少对生物体内其他生化过程的干扰。
为了实现生物体和EV间的正交反应，工程改造主要通过化学交联和免疫亲和法、膜插入法、代谢标记法这三种生物学方法标记到EV表面。基于EV表面蛋白和抗体/适体的免疫亲和方法具有高特异性，但分离成本高，产率低。相比之下，膜插入自然地将脂质或脂质模拟物嵌入到EV膜中。膜插入虽然适用性更广，成本更低，但其特异性相对较低。代谢工程技术使糖、脂类和含有生物正交官能团（如叠氮化物、炔烃和醛基）的氨基酸通过代谢活动自然修饰到生物体表面。其中代谢工程确保了高特异性和对EV完整性的最小破坏，促进了体内应用。
首先，考虑到EV的规模化生产是临床审批的关键挑战，磁珠、微流控芯片和微阵列芯片的利用可以使之与工程EV正交连接，从而分离获得所需EV种群。这种分离方法可以减少异质性，实现规模化生产。
其次，工程改造的EV纳米探针能够实时动态监测EV在体内的分布、运输和功能。这种利用SPAAC反应将EV与荧光分子连接起来的生物成像技术，具有非侵入性和高度特异性，有效克服了目前在细胞和组织内跟踪和生物成像EV的技术限制。
接着，对于癌症的早期诊断，基于click化学的放大电化学生物传感器也可以提供一种可靠、方便、灵敏的方法，克服了早期疾病患者体液中外泌体浓度低的挑战。尽管存在一些局限性，但这些生物传感器具有巨大的临床潜力，为疾病诊断提供有价值的信息，特别是在早期肿瘤检测和预后监测方面。
最后，要强调的是基于EV的治疗方法的瓶颈之一是靶向能力不足。生物正交化学不仅扩展了EV的诊断功能，还提高了其靶向特异性。通过药物多功能化或糖代谢工程，EV给药系统可用于治疗多种疾病，如肿瘤、关节炎、缺血性中风和心脏病。近年来，EV药物递送已从小分子化合物扩展至纳米酶、肽和细胞，使EV具有主动或被动靶向递送药物的能力。然而，配体靶向策略的有效性受到肿瘤细胞中受体的有限可用性和异质性分布的限制。幸运的是，生物正交代谢糖工程通过对肿瘤部位的功能化糖蛋白进行工程改造，拓宽了正交性的范围，增强了体内靶向治疗的疗效。该方法能够精确标记肿瘤，通过药物与肿瘤的正交点击反应，促进它们的靶向结合，以干扰肿瘤来源的外泌体（TDEs）形成，防止其被肝Kupffer细胞吸收，抑制其与远端肿瘤的通讯，从而有效抑制转移。这展示了点击化学在抗转移策略和外泌体靶向治疗中的潜力。
总之，生物正交标记囊泡在分离、生物成像和靶向治疗等方面具有广泛的应用前景，为从化学生物学到药物递送等EV相关研究提供了重要工具。然而，生物正交标记的应用仍面临一些挑战和限制，例如肿瘤内注射Ac4ManNAz可能引发血管损伤、叠氮糖泄漏或标记不均匀等问题。通过优化天然分子衍生物的化学结构，如改变唾液酸类似物中酰基侧链的长度，开发针对肿瘤微环境响应的Ac4ManAz，或构建具有生物响应性的二硫键自组装实体，可以提高肿瘤或EV的标记效率。为推动临床应用，深入理解生物正交标记过程中涉及的代谢路径对于评估其体内行为至关重要。此外，生物正交功能化EV的商业化应用还需要标准化的纯化工艺和质量控制。
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