Tyszka AS, et al. (2024). Sequencing historical RNA: unrealized potential to increase understanding of the plant tree of life. Trends in Plant Science, doi: 10.1016/j.tplants.2024.11.004.
（2024年11月29日发表，全文参考翻译如下，约5千字）
摘要：最近的研究表明，转录组测序需要将组织保存于超低温的观点是一个误解。在此，我们概述了这一误解的潜在根源，以及它可能对已发表的植物转录组的地理分布造成的偏差。我们通过概述转录组可以回答的有关植物生命之树塑造力的问题，强调了确保多样化取样的重要性。我们讨论了如何通过扩大转录组测序范围，包括现有样本，可以促进该领域的发展，更充分地利用生物学标本。我们希望这篇文章能鼓励扩大当前 “标本组学 ”研究的趋势，将历史RNA的全转录组测序纳入其中。
关键词：历史RNA，转录组学，标本组学，RNA保存，RNA-seq
RNA-seq组织保存误解的起源
自从确立RNA在中心法则中的关键作用以来，研究人员就一直致力于利用这种生物分子来连接基因型和表型。识别基因表达模式——即特定基因在何时何地被转录——通常是发现基因功能和调控机制的关键。早期的RNA提取实验方案要求通过快速冷冻停止酶活性，因为基因表达对外部刺激非常敏感。这些实验方案被应用于早期的多基因表达研究，利用如微阵列技术等需要事先已知基因序列的技术。2000年代下一代测序技术的出现，使研究人员能够更快速、更廉价地研究RNA序列的差异，并提供了基因表达水平以及RNA转录本序列本身（即转录组）。转录组已成为一个具有成本效益的基因组资源，广泛应用于多个生物学学科。
除了极大地改变RNA研究的格局外，下一代测序还为DNA研究开辟了新的前沿，包括激发了对古DNA的研究。像尼安德特人项目等几个重大项目，将古DNA的实用性推到了科学研究的前沿。与古DNA的研究相比，RNA作为一种历史生物分子，直到现在才开始在现代研究中占有一席之地。
我们认为，历史RNA研究匮乏的原因，至少部分是由于早期的实验方案指出RNA-seq所需的组织必须保存在超低温下。在这里，我们讨论了几项最近的研究，表明并非所有的研究问题都需要这种处理。如今，测序转录组已成为获得基因序列的常见方法，而不仅仅是表达谱数据。然而，大多数研究仍然遵循要求快速冷冻以最大化基因表达准确性的实验方案，无论该研究是否会使用表达信息。这种快速冷冻方法使得从生长在偏远地区的植物中获取组织变得特别困难，从而限制了可以使用转录组学方法研究的植物物种。通过在不必要时省略这一繁琐的保存步骤，并利用植物标本馆提供的大量组织资源，历史RNA的研究有可能为我们提供独特的进化见解，加速对全球生物多样性的发现。
多样化的转录组测序在理解植物生命之树中的重要作用
分子序列数据已经成为理解植物生命树的不可或缺的工具。转录组提供了成千上万个基因区域的序列，可以帮助解决有争议的系统发育关系，并解答一系列长期存在的进化问题。这种方法通常被称为系统转录组学（phylotranscriptomics，基因组学与转录组学的结合），并为分子系统学领域注入了新的活力，提供了以往较小数据集无法获得的见解。
比较多个物种的转录组可以提供关于物种和基因进化历史的信息。多种过程可能导致基因间的系统发育不一致（即基因树冲突），这可以通过转录组学有效研究。基因树冲突将微进化事件，如种群大小波动、渐渗杂交、负向频率依赖选择，与宏观进化事件联系起来，如分支内表型的分布或大灭绝事件对种群的影响。通过转录组研究基因树还可以帮助研究人员推测基因重复事件，基因重复提供冗余的基因拷贝，使得基因能够进行新的或次要功能化，而不影响原有拷贝的功能。这一过程有助于促成新的适应性变化，从而改变谱系的进化轨迹，可能促进物种的多样化。例如，十字花科植物中的甜菜碱色素沉积和对环境压力的适应。通过非模式物种进行的大规模转录组测序计划揭示，早前预测为进化新颖性驱动力的全基因组复制在植物生命之树中广泛存在。
转录组衍生的编码序列还使研究人员能够比较非同义替换和同义替换率，从而推测选择压力。这些推测为测试特定基因或基因家族的适应重要性提供了手段，包括在无法进行实验操作的大型分支和物种中。通过比较从转录组推导的基因树，研究人员进一步能够识别具有不同分子进化速率的基因，从而深入了解选择和突变过程如何在基因组和物种间变化。
当某一植物分支的样本获取困难，或物种数量非常庞大时，研究人员常常依靠植物标本馆的标本和通过靶向序列捕获方法预先识别的基因区域。来自该分支子集物种的转录组数据使研究人员能够确定有信息价值的基因靶向，随后在其他分类群中进行测序，通常用于推测系统发育。尽管依赖序列捕获的方法在自身上具有价值并且具有成本效益，但此类研究可能受到错误的同源性识别问题的影响，因为很难确保生成的序列是严格的同源基因，而不是旁系同源基因。此外，来自分支特定的序列捕获研究的数据通常难以被轻易纳入到未来的跨分支分析中。相比之下，转录组组装不依赖于预先识别的基因，可以补充任何基于编码序列的捕获数据集，因而成为一种易于重复利用的资源。
当前获取转录组数据方法所导致的偏差
进行新的植物采集以用于RNA-seq的挑战，可能导致现有植物转录组组装在地理分布上的偏差（图1）。非模式物种转录组采样工作面临的最大障碍之一是标准的RNA采集实验方案推荐在采集过程中对样本进行快速冷冻。快速冷冻需要将液氮运输到采集地点，这使得进行转录组学研究的组织采集比采集用于大多数DNA提取的叶片并放入硅胶中要在后勤上更加困难。因此，RNA提取的组织采集通常在液氮容易获取的地方进行，这限制了采集区域的范围。一个替代方法是使用RNAlater®（Ambion）盐溶液；然而，采用这种方法采集样本会比较繁琐，增加了材料成本，并且仍然需要长期冷藏存储。尽管植物园可以为转录组学提供宝贵的新鲜样本来源，但这些机构的物种分布也存在地理偏差。取消对后勤挑战性保存方法的感知需求，将使研究人员能够扩大其在系统转录组学项目中的采集工作，并更好地与那些可能无法使用超低温存储资源的团队合作，包括在野外站点和偏远采集地点的团队。除了促进对新采集样本的更广泛测序外，摆脱对专门保存方法的依赖，还提供了一个机会，可以通过利用现有生物收藏中的标本，开辟转录组学的全新前沿。
图1. 全球的维管植物中，仅有一小部分已进行转录组测序，并且它们的分布偏向北半球。所有在植物信息与生态网络（BIEN）数据库中具有纬度/经度坐标对的维管植物的坐标（https://bien.nceas.ucsb.edu/bien/）被汇总，以估算在美国国家生物技术信息中心（NCBI）序列读取档案中具有一个或多个转录组的物种比例的热图。较深的颜色表示具有转录组的物种比例较高，而在BIEN数据库中记录的物种少于100种的区域则为灰色。详细信息和脚本可在 https://github.com/alexatyszka/preservation-review-2024 查阅。
从干燥组织中获取转录组为全球植物采样提供了一个有前景的路径
在生物分子学中，“历史性（historical）”一词通常指的是来自博物馆、标本馆或其他未专门为测序保存的来源的材料。植物标本压制法已有400多年的历史，这种保存方法所保存的标本由于大规模标本DNA测序（植物标本基因组学）、形态性状数据的计算分析和物种分布建模等技术的出现，已经证明在研究中远超其最初的使用目的。全球的植物标本馆蕴藏着丰富的生物多样性，尽管由于非随机采集实践和殖民主义的影响，这些标本存在偏差，使得它们成为一个不完美但却强大的资源。从历史生物分子中恢复遗传信息的成功依赖于样本的完整性以及其保存和存储方法。基于DNA的提取方法可以追溯到1985年就已开始用于植物标本，并且如今仍被广泛使用。然而，从历史组织中提取RNA是最近才开始的工作。
最近，关于历史RNA测序的几个例子已在无脊椎动物，特别是被冻土保存的动物中发表。研究人员成功从19世纪和20世纪的狼皮中提取了RNA，来自大约14000年前冻土中保存的犬科动物的RNA，是迄今为止最古老的测序历史RNA。尽管冻土可以说是古老组织的“深冻库”，但获得可用RNA所需的“冷冻保存”假设，最近通过对约130年历史的袋狼（Thylacinus cynocephalus）标本的RNA测序被推翻，该标本存放在博物馆里。
目前，关于植物领域历史RNA的研究主要限于使用硅胶保存的样本。在对有花植物毛茛目（Ranunculales）进行的植物转录组学研究中，He等使用了储存在-20°C冰箱中的硅胶干燥组织进行RNA提取，而不是对组织进行急冻。通过检查组装的转录本数量，作者发现，得到的转录组与急冻对照样本的结果是相当的。随后，作者进行了多项分析，证明这些数据可用于转录组学研究。Ruiz-Vargas等人则使用储存3-6个月的硅胶保存组织提取RNA，采用稍微修改的Sigma Spectrum RNA提取实验方案，研究了Pitcairnia属（凤梨科）的物种群体遗传学。通过将预测的编码序列数与最接近的高质量基因组组装【如菠萝 (Ananas comosus)基因组】进行比较，作者发现大多数情况下预测的编码序列数是相似的。值得注意的是，Ruiz-Vargas等报告的RNA完整性评分低于常推荐的7.0基准，最低可达2.3。然而，尽管这些评分较低，得到的转录组在质量指标上与高完整性样本相当，甚至在某些情况下更好。植物样本中保存方法对RNA稳定性的影响尚未在较长的时间尺度上得到深入研究。未来的研究将帮助揭示干燥组织在RNA提取之前可以在常温下存储的时长。
古老种子也展示了植物RNA的长期存留现象。Rollo等人至少在1980年代就发现了这一现象，最近几年随着技术改进（如冷冻干燥种子以便于运输），这一研究方向得到了扩展。著名的Judean椰枣种子的例子中，研究人员成功让2000年前的种子发芽，表明RNA是完整的，而RNA是种子发芽所必需的。种子RNA稳定性的时间限制尚不明确。除了种子，病毒蛋白质外壳已知能够维持RNA的完整性，几项研究显示成功提取了古病毒颗粒中的RNA。农业和植物标本保存方法无意中保存了病毒RNA，时间跨度从几十年到几百年不等。例如，研究人员从750年历史的大麦籽粒样本中恢复了RNA病毒群体。另一个例子是通过1928年采集的木薯（Manihot esculenta）标本，精确追溯并改善了RNA病毒的进化历史。来自1932年标本的干燥柑橘皮样本也成功识别并组装了RNA病毒的基因组。尽管物种和组织类型之间的差异可能会影响RNA保存过程（例如代谢物和干燥速度的差异），但这些过程目前尚不完全理解。
结论与未来展望
我们认为，RNA研究的历史，尤其是RNA在基因表达研究中的作用及相关实验方案，导致研究人员在许多情况下过分强调了RNA降解的速度和程度。最近的工作表明，从历史组织中恢复RNA并不需要RNA提取实验方案的重大突破。相反，似乎历史RNA的提取在之前并未得到充分尝试。过度依赖急冻保存可能也加剧了全球转录组采样中的地理偏差（见图1）。
最近成功的干燥植物组织RNA测序为进一步创新开辟了多个方向。基于DNA的植物标本基因组学（herbariomics）现已得到广泛应用，但RNA标本基因组学在大规模应用上的可行性尚需验证。然而，我们的持续研究表明，这是未来研究的一个有前景的方向，因为我们已成功从植物标本压制组织中组装出转录组（未公开数据）。有理由认为，在稳定的温湿度条件下保存的标本，在许多情况下会导致RNA的可接受复原率。此外，RNA提取只需要相对少量的组织（约40 mg），这在许多情况下与植物标本馆的采样政策相兼容。通过转录组学探讨灭绝或濒危植物物种的遗传学，将有助于深入了解现存物种在植物进化树中的演化过程。
越来越多的研究表明，保存在常温下的生物体中RNA具有较长的保存时间，为新型研究途径提供了框架。研究可以追求的方向主要取决于从历史样本中提取RNA的质量和数量。来自袋狼的历史RNA显示，特定组织的基因表达差异在超过一个世纪的时间里得以保持。各种植物组织类型，如花组织和叶片，可能在一定程度上保留一些特定组织的表达信息，探索这种信号的保存程度可能为历史标本提供额外的信息来源。进一步检查存储条件、初始保存方法和标本存储时长的组合，将有助于研究人员理解如何选择高成功概率的历史样本进行测序。
基于RNA的植物标本基因组学将为植物标本馆收藏提供新的应用维度，而植物标本馆对研究植物生物多样性至关重要。许多植物标本馆面临着越来越大的资源压力，一些主要机构（如杜克大学）已选择关闭其植物标本馆。在现代化的外部压力和内部偏见下，植物标本馆收藏的集体和公平改进应与转录组学在欠研究植物群体中的负责任扩展并行推进。利用植物标本进行RNA研究的新项目提供了进一步展示这些标本馆收藏价值的机会，同时也可以增加全球范围内尤其是服务不足和资金匮乏的机构与地区获取转录组学生物多样性研究的机会。尽管这种增加的访问可能仍存在偏倚，但也有助于缓解当前转录组学采样中的地理和系统发育偏差。
历史RNA的测序提供了改善基因组尺度分子研究的机会，减少对不必要昂贵实验方案的依赖。在科学问题适用的情况下，取消对组织急冻保存的要求可以整体降低野外采集的成本，并为全球科学界提供更公平的转录组学研究机会。最近的讨论还指出，长期冷藏保存的成本，既在机构层面，也在全球排放和气候变化的背景下，需要加以考虑。随着测序和生物信息学方法的进步，历史RNA的应用价值可能会持续增加，为未来的研究开辟更多的探索方向（见未解答问题）。
未解答问题
RNA在干燥植物标本中能存活多久？干燥标本的制备方法如何影响RNA降解？RNA降解在不同植物类群特征中如何变化？
古DNA研究显示，由DNA损伤（如脱氨基）引起的序列错误呈现一致模式；类似的过程在历史RNA中会产生怎样的影响？标本的年龄、存储条件、提取的RNA量以及测序深度等技术因素如何影响历史RNA损伤的下游影响？
不同类型的历史RNA测序结果能区分到什么程度？历史mRNA能否用于指导历史DNA的基因组注释？样本中的小RNA，如miRNA和siRNA，是否能提供关于这些RNA序列和功能的物种特异性信息？
历史标本中基因表达模式的信号能保持到什么程度？历史植物和动物标本能否用于差异基因表达研究？哪些因素限制了对基因表达和其他历史RNA研究方面的推论？
参考文献：略。
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