檬果樟属（Caryodaphnopsis）是樟科中的一组热带树木（约20个物种），具有两种分布：十个物种分布在东南亚，而八个物种则局限于南美的热带雨林。之前的研究利用两个核标记基因解析了拉丁美洲五个物种之间的关系。然而，亚洲物种之间的系统发育关系仍然不太清楚。在本研究中，我们首次确定了檬果樟（C. henryi）的完整线粒体基因组（mitogenome）、叶绿体基因组（plastome）和核核糖体基因（nrDNA）序列，长度分别为1,168,029 bp、154,938 bp和6495 bp。我们在檬果樟的线粒体基因组中发现了2233个重复序列和368个潜在的SSR（简单序列重复），并在其线粒体基因组和叶绿体基因组之间发现了50个同源DNA片段。基因顺序分析揭示了檬果樟（C. henryi）、望春玉兰（Magnolia biondii）和莲叶桐（Hernandia nymphaeifolia）的线粒体基因组中存在大量重排，其中仅有六个保守的聚集基因。为了重建亚洲十个檬果樟属物种之间的关系，我们创建了三个数据集：一个是线粒体基因组（编码基因和十个基因间区），另一个是叶绿体基因组（整个基因组），还有一个是核核糖体基因。根据线粒体基因组、叶绿体基因组和nrDNA数据集，所有22个檬果樟属（Caryodaphnopsis）个体在系统发育树中分别被划分为四、五和六个不同的支系。
本研究显示了檬果樟属（Caryodaphnopsis）物种的核基因组和细胞器基因组数据之间及其内部的系统发育冲突。中国西南地区的Hekou和Malipo的同域檬果樟属物种可能与不完全谱系分化、叶绿体捕获和/或杂交有关，这些因素在其进化历史中使物种混合成一个复杂体。 檬果樟属（樟科）的亚洲物种复杂体中的系统发育不一致性Phylogenetic incongruence in an Asiatic species complex of the genus Caryodaphnopsis (Lauraceae)
时间：2024 杂志：BMC Plant Biology 影响因子：4.3 分区：1/2区
1、植物材料和地理分布
从中国和越南收集了十种檬果樟属物种的新鲜叶子，用硅胶干燥保存。分布数据通过标本馆记录汇编，标本存放在广西师范大学标本馆（见表1）。图1显示了六种檬果樟属物种的果实。此外，檬果樟（C. henryi）叶绿体基因组序列已存入月桂科叶绿体基因组数据库（LCGDB，LAU00015，https://lcgdb.wordpress.com）。檬果樟的完整线粒体基因组序列已存入 NCBI（OR987149）。
表 1 本研究中采集的檬果樟属（Caryodaphnopsis）物种及其凭证标本
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图1 六种檬果樟属物种的果实（A: C. tonkinensis, B: C. henryi, C: C. malipoensis, D: C. sp. 1, E: C. sp. 2, F: C. sp. 3） 从十种檬果樟属物种的叶片中提取了高质量基因组DNA，并进行Illumina文库制备和二代测序。使用CTAB技术（4% CTAB、1% PVP和0.2% DL二硫苏糖醇）从2克新鲜或硅胶干燥的叶片中分离基因组DNA。根据制造商手册（Illumina），打断的DNA片段用于构建500 bp插入文库。每个DNA样本添加标签，获得了超过4.0 Gb的数据。使用二代测序为C. henryi获得了总计27.9 Gb、长度为150 bp的序列reads。C. henryi的幼叶使用Oxford Nanopore PromethION平台进行提取和三代测序。使用SDS方法从叶片中提取高质量的基因组DNA。在使用SQK-LSK109（Oxford Nanopore Technology）构建文库后，使用基于PromethION平台测序进行DNA测序，产生了20.7 Gb的原始数据，平均读取大小为27,600 bp。使用GetOrganelle 1.7.5组装檬果樟属物种的非环状线粒体基因组、完整的叶绿体基因组和nrDNA序列。为了组装Caryodaphnopsis henryi的完整线粒体基因组，最初使用GetOrganelle组装C. henryi的Illumina测序数据。在获得C. henryi的Nanopore第三代测序reads后，首先使用Porechop修剪接头，然后通过将修剪后的reads与使用BLAST+（参数-evalue 1e-200）组装的支架进行比对，获得与线粒体相似的长序列子集。最后，这些长读取和通过GetOrganelle扩展的与线粒体相关的短reads一起使用Unicycler进行混合组装。C. henryi的组装结果获得了两个推测的线粒体序列，包括一个长度为968,798 bp的线性序列和一个长度为199,231 bp的环状序列。使用GeSeq对线粒体基因组进行注释，以北美鹅掌楸（Liriodendron tulipifera，KC821969）和望春玉兰（Magnolia biondii，MN206019）作为参考。随后，使用Geneious Prime进行了详细注释。使用OGDRAW可视化环状线粒体基因组图。
4、重复和同源DNA分析
使用REPuter（https://bibiserv.Cebitec.uni-bielefeld.de/reputer）可视化C. henryi线粒体基因组中的正向、回文、反向和互补重复序列，设置最小重复为30 bp，hamming距离为3，序列相似性大于90%。使用TRF（https://tandem.bu.edu/）以默认参数查找串联重复序列。使用MISA-web（http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/）识别C. henryi线粒体基因组中的简单序列重复（SSRs），其基序大小为1到6个核苷酸，阈值分别为8、5、5、4、4和4。通过分析叶绿体基因组与线粒体基因组之间的序列相似性，使用BLASTN检测交流转移的DNA片段，e值为1e-5。结果使用TBtools v2.012中的Circos模块进行可视化。使用Mauve v.2.4.0软件确定檬果樟、莲叶桐（ON023262）和望春玉兰（MN206019）之间的线粒体基因组重排。使用RAWGraphs（https://app.rawgraphs.io/）描述檬果樟、莲叶桐和望春玉兰线粒体基因组中基因顺序的共线性关系。所有序列矩阵使用MAFFT进行比对，并使用Geneious手动修改。线粒体、叶绿体和核核糖体串联序列的三个数据集包括以下内容：线粒体数据集包含41个编码蛋白基因、9个内含子序列和10个基因间区；叶绿体数据集包含完整的叶绿体基因组序列；nrDNA数据集为ETS-18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S。使用IQ-TREE（v2.1.2）进行最大似然（ML）分析，采用1000次重复。DNA替代模型选择为TVM+I+G（mtDNA）、GTR+I+G（cpDNA）和GTR+G（nrDNA）。基于GTR+F+I（mtDNA）、GTR+F+I+G4（cpDNA）和GTR+F+I（nrDNA）模型使用MrBayes（v3.2.7）进行贝叶斯推断（BI）分析。BI分析以随机树开始，每1000代进行一次抽样。前20%的树被丢弃作为burn-in，剩余的树用于生成多数规则共识树。使用FigTree软件（v1.4.0）进行系统发育树的可视化和编辑。 使用Illumina HiSeq 2500和Oxford Nanopore PromethION平台分别进行第二代和第三代测序,对檬果樟（C. henryi）的DNA进行了提取和测序。共使用了27.9 Gb长度为150 bp的原始reads和约20.7 Gb平均读取长度为27,600 bp的Nanopore长读长reads数据进行基因组组装。我们成功地使用Illumina短读长和Nanopore长读长reads组装了檬果樟的完整线粒体基因组和叶绿体基因组,包括一个长度为968,798 bp的大线性contig和两个长度为199,231 bp和154,938 bp的小环状contigs。整个线粒体基因组的总长度为1,168,029 bp,碱基组成如下：A: 26.7%,T: 26.5%,G: 23.4%,C: 23.4%,GC含量为46.8%。檬果樟（C. henryi）粒体基因组中所有基因的位置及其功能分类如图2A所示。线粒体基因组包含65个独特的基因,包括41个编码蛋白基因(PCG)、21个转移RNA(tRNA)基因和3个核糖体RNA(rRNA)基因(表2)。叶绿体基因组长度为154,938 bp（GC含量39%）,包含113个独特的基因,包括79个编码蛋白基因、30个tRNA基因和4个rRNA基因（图2B）。图1 C. henryi线粒体基因组(A)和叶绿体基因组(B)的基因图。使用GeSeq对基因组进行注释。圆外的基因顺时针转录,圆内的基因逆时针转录。 表2 C. henryi线线粒体基因组按类别分类的编码基因。在C. henryi的线粒体基因组中，我们检测到2233个重复序列，这些重复包括1093个长度为30-366 bp的正向重复，982个长度为30-25,242 bp的回文重复，40个长度为30-39 bp的反向重复，37个长度为30-38 bp的互补重复，以及81个长度为2-53 bp的串联重复（图3A）。在C. henryi的线粒体基因组中共检测到368个潜在的简单序列重复（SSRs），其中279个为单核苷酸，66个为二核苷酸，9个为三核苷酸，8个为四核苷酸，5个为五核苷酸，1个为六核苷酸。在单核苷酸重复中，A/T（86.74%）占主要比例（图3B）。
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图3 C. henryi线粒体基因组中长重复序列（A）和简单序列重复（SSRs）（B）的数量和分布
C. henryi的线粒体基因组序列约为其叶绿体基因组的7.5倍。在线粒体基因组和叶绿体基因组之间，我们发现了总共50个同源DNA片段（表S1，图4）。片段长度范围为39-5262 bp。总插入片段长度为23,583 bp，占线粒体基因组长度的2.02%。在这些片段中定位了六个tRNA基因（trnH-GUG、trnM-CAU、trnN-GUU、trnV-GAC、trnW-CCA、trnP-UGG）。我们还检测到叶绿体基因片段，如rrnS和trnD-GUC，位于线粒体基因组中。
图4 C. henryi线粒体基因组和叶绿体基因组之间的同源序列。蓝色环形片段代表线粒体基因组,绿色环形片段代表叶绿体基因组,线代表同源片段。内圈中不同颜色代表基因密度。我们对C. henryi的线粒体基因组序列与已发布的莲叶桐和望春玉兰的线粒体基因组序列进行了同源性和重排分析。在编码片段和非编码区域中都检测到了频繁的重排事件（图S1）。对于蛋白编码基因（PCGs），C. henryi和望春玉兰的线粒体基因组之间广泛保守的11个片段（图5）包括matR-nad1、nad1-ccmB-rps11、nad5-nad3-rps12、cob-rps14-rpl5、rpl2-rps19-rps3-rpl16、rps1-rps7、cox2-nad6-nad5-nad7、sdh4-cox3-atp8、atp4-nad4L、nad1-nad5和rps13-nad1，而C. henryi和莲叶桐的线粒体基因组之间广泛保守的7个片段包括rps11-nad9、rps19-rps3-rpl16-rpl10、nad5-nad7、rpl5-rps14-cob、sdh4-cox3-atp8、nad5-nad3-rps12和sdh3-atp4-nad4L。 图5 莲叶桐、望春玉兰和檬果樟的线粒体基因组中的基因顺序。莲叶桐的线粒体基因显示在左侧，檬果樟的线粒体基因显示在中间，望春玉兰的线粒体基因显示在右侧，不同颜色表示相关的共线性部分。
以C. henryi的线粒体基因组为参考,我们进一步组装了60个线粒体片段,包括41个线粒体蛋白编码基因序列、9个内含子序列和10个基因间区序列,涵盖了亚洲10种檬果樟属物种的21个个体。基于这60个区域构建的线粒体矩阵（表3）包含166,057个字符,其中363个（取决于共识阈值）是简约信息字符（PICs）。使用两个新樟属（Neocinnamomum）物种作为外群,利用线粒体矩阵重建了系统发育树（图6A）。22个檬果樟属个体被划分为四个不同的分支。分支I仅包括一个C. burger个体（ML-BS = 100%，BI-PP = 1.00）。分支II包括两个C. henryi个体（ML-BS = 95%，BI-PP = 1.00）。分支III包括C. bilocellata、C. latifolia和一个疑似新物种C. sp. 2的个体（ML-BS = 97%，BI-PP = 1.00）。分支IV包括C. laotica、C. malipoensis、C. metallica、C. tonkinensis和两个疑似新物种C. sp. 1和C. sp. 3的个体（ML-BS = 97%，BI-PP = 1.00）。 图6 基于线粒体（A）、完整叶绿体基因组（B）和核糖体DNA（C）序列,使用未分区的贝叶斯推断（BI）和最大似然（ML）法构建了11种檬果樟属的分子系统发育树。树根植于川鄂新樟（N. fargesii）和海南新樟（N. lecomtei）的序列上。分支上的数字为ML bootstrap值（BS）和BI后验概率（PP）。
5、质体基因组序列的系统发育
本研究首次测定了来自亚洲十种檬果樟属物种的21个完整叶绿体基因组。它们都被组装成具有典型四分体结构的单个环状基因组，包括一个长度为86,035 bp（C. henryi）至91,966 bp（C. sp. 2）的LSC区域，一个长度为17,310 bp（C. sp. 3）至17,701 bp（C. henryi）的SSC区域，以及一对长度为19,694 bp（C. sp. 2）至25,601 bp（C. henryi）的IR区域（表4）。叶绿体基因组比对共有155,629个字符，其中705个（0.45%）是简约信息字符（PICs）。使用完整叶绿体基因组矩阵重建了檬果樟属物种的系统发育树（图6B）。在檬果樟属中确定了五个支持度高的分支：分支I包括一个C. burger和两个C. henryi（ML-BS = 100%，BI-PP = 1.00）；分支 II包括四个C. laotica和C. tonkinensis（ML-BS = 98%，BI-PP = 1.00）；分支III仅包括一个C. metallica（ML-BS = 98%，BI-PP = 1.00）；分支IV包括另外两个C. tonkinensis和一个疑似新物种C. sp. 1（ML-BS = 71%，BI-PP = 0.41）；分支V包括C. bilocellata、C. latifolia、C. malipoensis以及两个疑似新物种C. sp. 2和C. sp. 3（ML-BS = 71%，BI-PP = 0.41）。
本研究首次测定了来自亚洲十种檬果樟属物种的21个个体的nrDNA序列。nrDNA序列的长度范围为6482 bp（C. bilocellata）至6537 bp（C. metallica）（表5）。在这些nrDNA序列中发现了三个rRNA基因和三个转录间隔区。对于26S大亚基rRNA（26S）区域，长度在3386到3388 bp之间；对于18S小亚基rRNA（18S）区域，长度为1811 bp；对于5.8S rRNA（5.8S）区域，长度为159 bp；对于外部转录间隔区（ETS），长度在653到656 bp之间；对于ITS1区域，长度在214到271 bp之间；对于ITS2区域，长度在213到222 bp之间。核糖体矩阵的长度为6672 bp，包含175个（2.62%）简约信息字符（PICs）。22个Caryodaphnopsis个体被分为六个分支（图6C）。分支I仅包括一个C. burger（ML-BS = 100%，BI-PP = 1.00）。分支II包括两个C. henryi（ML-BS = 90%，BI-PP = 0.95）。分支III包括一个C. metallica和两个C. bilocellata（ML-BS = 98%，BI-PP = 0.99）。分支IV包括两个C. malipoensis（ML-BS = 83%，BI-PP = 1.00）。分支V包括C. latifolia和C. tonkinensis（ML-BS = 94%，BI-PP = 1.00）。分支VI包括C. laotica的个体以及三个疑似新物种C. sp. 1、C. sp. 2和C. sp. 3（ML-BS = 94%，BI-PP = 1.00）。 ![]()
本研究展示了通过Illumina和Nanopore测序技术获得的樟科（Lauraceae）木本植物的完整线粒体基因组（图2A）。截至目前，已有三个目和八个科的线粒体基因组在樟科类植物中被测序。檬果樟（C. henryi）的线粒体基因组长度为1,168,029 bp，比莲叶桐和望春玉兰的线粒体基因组都要大。檬果樟、莲叶桐和望春玉兰的线粒体基因长度相似。C. henryi中共有65个线粒体基因，总长度为41,938 bp，比望春玉兰的基因少800 bp，比莲叶桐的基因多49 bp。C. henryi的线粒体内含子和基因间区域总长度为1,126,191 bp，比望春玉兰多201,829 bp，比莲叶桐多632,275 bp。线粒体基因的数量没有显著差异，非编码DNA含量的变化与线粒体基因组大小的变化在统计上是相关的。此外，在九种胡椒目（Piperales）植物中也报告了线粒体基因间区域的显著长度变化。陆生植物的线粒体基因组大小变化可能受到多种因素的影响，包括逆转录转座子增殖、通过同源重组生成重复DNA、通过细胞内转移从叶绿体或核基因组引入外源序列，或线粒体DNA的水平转移。这种多样性在许多植物物种中都有报道，线粒体基因组的大小范围从66 kb（Viscum scurruloideum）到11 Mb（Silene conica）。然而，在不同物种中，线粒体基因组大小的增加可能由不同因素引起。一方面，在C. henryi的线粒体基因组中识别出了2233个重复序列和368个简单序列重复（SSRs）。该线粒体基因组显示出大量散在重复序列，主要由串联重复、正向重复和回文重复组成。这些重复对线粒体基因组的重组至关重要，因为它们是影响线粒体基因组大小和结构变化的原因之一。线粒体基因组中重复序列的存在可以增加重组的可能性，导致基因组结构的变化，这反过来可能与基因表达和功能相关。另一方面，植物线粒体基因组的结构和进化过程使其更容易接受和整合外源DNA。已经多次报道从叶绿体到线粒体的水平基因转移，但转移片段的长度和数量在不同物种之间差异显著。在本研究中，我们发现C. henryi中有50个同源DNA片段是从叶绿体基因组转移到线粒体基因组的。因此，基因间区域的长度变化可能导致樟科类植物谱系中线粒体基因组长度的差异，这主要是由于在进化过程中重复序列的频繁重组和外源序列的整合。基因组重排事件，如基因顺序变化，可以反映物种之间的进化距离和生态适应。这些事件在不同位置创造具有保守基因的现存物种，近缘物种往往具有相似的基因组或共享大部分基因。基因同源性分析揭示了望春玉兰、莲叶桐和檬果樟的线粒体基因组中一系列重排。仅在檬果樟、莲叶桐和望春玉兰的线粒体基因组中发现了六个高度保守的基因簇。此外，与莲叶桐不同，檬果樟和望春玉兰的线粒体基因组包含了十一组基因簇。尽管檬果樟与莲叶桐的关系更为密切，但檬果樟与莲叶桐之间的保守基因簇数量少于檬果樟与望春玉兰之间的数量。植物线粒体基因组中蛋白编码基因的位置可能保守性较差。基因共线性分析揭示的基因组重排事件确实可以反映物种之间的进化距离和生态适应。 细胞核和细胞器基因组之间的系统发育不一致性,即细胞核-细胞器不一致性(cytonuclear discordance),是一种常见的现象。它表现为核标记基因和细胞器基因(如线粒体和叶绿体基因)之间存在明显不同的系统发育模式。这种不一致性通常归因于杂交和不完全谱系分选等过程。在檬果樟属中,物种在叶绿体和线粒体系统发育树上的位置与在核系统发育树上的位置不同(图7)。我们的系统发育分析揭示了檬果樟属内存在显著的细胞核-细胞器不一致性。C. bilocellata和C. metallica物种在核系统发育树上通常聚在一起,但在线粒体和叶绿体系统发育树上的位置不同。C. sp. 1、C. sp. 2、C. sp. 3和C. laotica物种在核系统发育树上聚在一起,但在线粒体和叶绿体系统发育树上的位置不同。这一发现与之前在其他植物中发现的核和细胞器基因不一致性的研究结果相似,包括苹果属、大叶钻天杨和澳大利亚植物Adenanthos属。这种不一致性可能揭示了这些物种在进化过程中经历的复杂的基因流模式。此外,C. tonkinensis物种的四个个体在核系统发育树上聚在一起,但在线粒体和叶绿体系统发育树上分散在不同的支系。C. tonkinensis的这种分离可能代表种内多样性,表明檬果樟可能是一个物种复合体。 图7 从三种不同数据集中获得的系统发育树：a. 线粒体；b. 核糖体；c. 叶绿体线粒体和叶绿体捕获是植物中一种现象，当植物物种通过杂交从另一个物种获得这些细胞器时会发生。在我们的研究中，檬果樟属的物种在核系统发育树中位置不同，但在线粒体和叶绿体系统发育树中聚在一起。我们在中国河口收集的C. latifolia和C. bilocellata个体的mtDNA和cpDNA数据表明，这两个物种之间存在姐妹关系。我们的系统发育分析似乎反映了来自其他物种的细胞器捕获。也许它们的地理分布重叠导致了线粒体和叶绿体的捕获。物种的地理分布重叠（图8）可以导致基因流动和杂交，可能导致线粒体和叶绿体之间的基因转移，这会影响它们在系统发育树上的聚类。图8 檬果樟属物种的地理分布和果实特征在基于其线粒体、叶绿体和nrDNA的系统发育树中进行了展示。 檬果樟属物种的分布显示出在物种丰富度相当的区域内有趣的遗传多样性模式。中国的马里坡县只有两个檬果樟属物种，它们共享相似的叶绿体和线粒体基因组（图9）。相比之下，中国的河口县有六个檬果樟属物种，具有多种类型的叶绿体、线粒体和核DNA序列。物种内和物种间的遗传多样性可能对进化过程有重要影响，包括适应环境压力、自然选择和疾病易感性。河口观察到的高遗传多样性表明，它可能是亚洲檬果樟属物种分布的中心，也是未来保护和育种工作的遗传资源来源。在其他植物群体中，例如热带雨林和高山地区，也观察到物种丰富度较高的地区具有更高的遗传多样性现象。图9 檬果樟属物种在本研究中的分布。每个物种的分布点用方形点表示。方形的颜色对应于物种在nrDNA数据中的分组。圆圈被分为三部分，分别表示在nrDNA、线粒体DNA和叶绿体DNA数据中的分组。同样的颜色表示在系统发育拓扑中属于一致组的物种。世界地图从资源与环境科学数据中心网站下载。本研究组装了檬果樟（C. henryi）的完整线粒体基因组序列，这是一种属于樟科的热带树木。C. henryi的整个线粒体基因组由一个长度为968,798 bp的大线性contig和一个长度为199,231 bp的小环状contig组成。该线粒体基因组包含65个基因，其中包括41个编码蛋白的基因、21个tRNA基因和三个rRNA基因。在C. henryi的线粒体基因组和叶绿体基因组之间存在50个同源DNA片段。比较基因组分析表明，檬果樟（C. henryi）、望春玉兰（Magnolia biondii）和莲叶桐（Hernandia nymphaeifolia）三种已测序线粒体基因组的大小和基因顺序差异显著。我们发现檬果樟属物种线粒体与核或叶绿体系统发育之间存在显著的不一致性。研究还揭示，具有共生分布的檬果樟属物种往往在叶绿体和线粒体系统发育树中聚集在一起。 1、惠通生物针对叶绿体、线粒体测序项目组装结果准确，可以提供定制化高级分析，欢迎联系我们获取小基因组文章专业解决方案，助力文章发表。
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