中药鉴定-五种肉苁蓉属植物质体基因组小单拷贝(SSC)区域的结构突变及种间鉴定

背景导读

  肉苁蓉属（Cistanche）物种是一组非光合寄生植物，属于列当科（Orobanchaceae）。该科包括非寄生性、半寄生性和全寄生性物种。列当科（Orobanchaceae）是研究植物寄生进化和表型可塑性的优秀模型系统。肉苁蓉属（Cistanche）作为非光合全寄生植物，完全缺乏叶绿素和功能叶片。它们的外观非常引人注目，由显著的、明亮的开花穗组成，似乎从光秃的土地上生长出来，这使它们得到了“沙漠风信子”的通称。大约20-30个被接受的物种构成了从西部（Macaronisia）到东部（中国西北）的肉苁蓉属（Cistanche）。肉苁蓉属（Cistanche）物种生长在沙漠地区，偶尔生长在沿海沙丘或盐沼地上，它们寄生在各种耐盐性灌木的根系上。肉苁蓉属（Cistanche）物种是高度有用的工业种植植物资源，可以固定沙丘并抵制沙漠化。肉苁蓉属（Cistanche）中的大多数物种传统上被用作滋补和药用植物，特别是以沙漠人参的名誉而闻名的肉苁蓉（C. deserticola）物种。多项研究报告了肉苁蓉属（Cistanche）物种的化学成分和药理作用。已从该属中分离出100多种化合物，包括苯乙烯醇、糖苷、碳水化合物、木脂素、虫草苷、铁线膜苷、绿原酸、醋酸苦参苷、山萘酚苷等。这些分离出的化合物表现出有趣的药理效应，如神经保护、免疫调节、延缓衰老、抗炎、抗骨质疏松、肝保护、抗氧化、抗菌、抗肿瘤和改善葡萄糖耐受性等。受这些药用特性和经济利益的驱动，人们过度开采和消费肉苁蓉（Cistanche）物种，使得这些物种在本文中有突出的重要性。

   迄今为止，中国已经报道了四个肉苁蓉属的物种，分别是肉苁蓉(C. deserticola)、盐生肉苁蓉(C. salsa)、沙苁蓉(C. sinensis)和C.tubulosa。然而，由于以下原因，肉苁蓉属的分类仍然存在争议：首先，现有的样本数量太少；其次，相关文献数量有限；第三，鲜花和干花的颜色差异很大，使基于花色的分类变得困难；第四，寄主植物的类型也难以确定。Najibeh Ataeia等人报道了肉苁蓉属大规模采样的分子系统发育分析结果，根据地理分布将其分为四个类群。然而，该研究未解决种间鉴定问题。此外，经济价值最高的物种肉苁蓉(C. deserticola)未被纳入分析。因此，我们旨在收集中国的肉苁蓉属物种，并通过系统发育分析确定其进化状态。

    叶绿体是绿色植物独有的细胞器，对光合作用起着至关重要的作用，具有自己的基因组。叶绿体基因组高度保守，包括基因组大小、结构、基因内容和组织。因此，叶绿体基因组是进行系统发育分析、遗传多样性评估和分子鉴定的极好工具。近年来，完整的叶绿体基因组序列已被成功地用作植物的超级条形码，以区分某些分类学上密切相关的物种，如芍药属。而在其他情况下，由于缺乏或减少了形态学特征来区分物种，如人参属物种的叶绿体基因组间隔区域的单核苷酸多态性或插入-缺失突变（Indels）等，已开发出基于叶绿体的DNA标记来鉴定药用植物。在我们的研究过程中，已经有四个肉苁蓉属物种的叶绿体基因组序列被发表。在这些物种的叶绿体基因组中，存在着严重的基因丢失和假基因化现象，但这些仅在补充材料中进行了展示和讨论。在本研究中，我们首次利用了五种完整的肉苁蓉属物种叶绿体基因组，来探究肉苁蓉属叶绿体基因组的结构变异情况，阐明肉苁蓉属物种中基因丢失和假基因化的现象，以及开发适用于各种肉苁蓉属物种的分子标记和DNA条形码，以区分各种物种。这些研究结果将有助于提高我们对肉苁蓉属物种之间的关系的理解，对于确保肉苁蓉属物种的有效和安全使用具有重要的价值。

五种肉苁蓉属植物质体基因组小单拷贝(SSC)区域的结构突变及种间鉴定

原名：Structural mutations ofsmall single copy (SSC) region in the plastid genomes of five Cistanche species and inter-species identifcation

杂志：BMC Plant Biology  IF=5.26    发表时间：2022

材料方法

1、植物材料及DNA提取

分别从中国的内蒙古自治区阿拉善盟、新疆维吾尔自治区塔城市、宁夏回族自治区青铜峡市和新疆维吾尔自治区和田地区采集了肉苁蓉属(Cistanche)的四个物种：C. deserticola、C. salsa、C. sinensis和C. tubulosa（见图7）。样本是从肉苁蓉种植基地取样，没有伤害野生物种，并遵守当地和国家的伦理要求。这些样本由林教授鉴定，并存储于中国医学科学院和北京协和医学院标本馆（标本登记号CMPB13484、CMPB13485、CMPB13486和CMPB13487）。新鲜样本用锡箔纸包裹，冷冻在液氮中，保存在-80°C，直到使用。使用植物基因组DNA提取试剂盒进行总DNA提取。用1% 琼脂糖凝胶电泳评估总DNA质量，并在Qubit 3.0上按照厂家说明进行定量。

Fig.7 四种肉苁蓉的地理分布及生长环境。Red dot: Cistanche deserticola, also known as ‘Rou Cong rong’ in Alxa League, Inner Mongolia Autonomous Region, China. Yellow dot: Cistanche salsa, also known as ‘Yan Sheng Rou Cong Rong’ in Tacheng City, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China. Blue dot: Cistanche sinensis, also known as ‘Sha Cong Rong’ in Qingtongxia City, Ningxia Hui Autonomous Region, China. Green dot: Cistanche tubulosa, also known as ‘Guan Hua Rou Cong Rong’ in Hotan Prefecture, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

2、基因组测序、组装和验证

每个物种约使用500ng的DNA构建了一个具有500bp插入大小的文库，按照生产商的建议，在Illumina HiSeq 4000平台（Illumina Inc., San Diego, CA, USA）上进行了双末端测序。因此，每个物种得到了约5G的数据。过滤后的reads被用于SPAdes（v.3.10.1）进行叶绿体基因组组装。为验证完成的叶绿体基因组拼接的正确性，使用Bowtie 2（v.2.0.1）将所有原始读取映射到叶绿体基因组草图上，并使用ggplot2绘制了覆盖图。

3、基因组注释、基因丢失和假基因的鉴定

使用 CpGAVAS2 在线网站对四个肉苁蓉属叶绿体基因组进行了注释。对于 BLASTn 和 BLASTx 的 E-value 截止值设定为 1E-10，之后使用 Apollo 基因组编辑器进行手动编辑。使用 CGView Server 统计每个基因和叶绿体基因组的 GC 含量。这四个组装好的叶绿体基因组已经在 GenBank 中登记，登记号分别为：MN614127（C. deserticola）、MN614128（C. salsa）、MN614129（C. sinensis）和MN614130（C. tubulosa）。此外，我们还从 NCBI 下载了 Cistanche phelypaea（NC_025642.1）的叶绿体基因组数据，并将其包括在我们的下游分析中。与 列当科非寄生植物 Rehmannia glutinosa（NC_034308）相比，那些与已知的编码蛋白基因类似但被截短或包含一个或多个移码突变的基因被定义为假基因。与列当科非寄生植物 R. glutinosa（NC_034308）相比消失的基因被定义为丢失基因。丢失基因和假基因的比率通过以下公式进行计算：丢失基因（假基因）比率 = 丢失基因（假基因）数目 / R. glutinosa 中编码蛋白基因数目。然后我们使用 R 包“PD”基于缺失基因和假基因的比率构建了拓扑树。

4、基因组比较

我们使用mVISTA 软件在Shufe-LAGAN模式下进行了肉苁蓉属（Cistanche）叶绿体基因组的比较基因组分析。在分析中，使用了已注释的Rehmannia glutinosa 叶绿体基因组作为参考。IRscope 分析了五个肉苁蓉属（Cistanche物种在LSC/IRs和SSC/IRs边界上的叶绿体基因组遗传结构。使用BLASTN，E值阈值设定为1e-10，识别出五个肉苁蓉属（Cistanche叶绿体基因组之间的保守序列。使用GSV 在线软件可视化同源区域和基因注释信息。使用Mauve 分析了五个Cistanche叶绿体基因组的基因重排。

5、鉴定高变异区域

为了鉴定最不同的区域，编写了一个自定义脚本从五个肉苁蓉属的GenBank文件中提取IGS区域的起始和结束位置。共发现了25个IGSs被这五个肉苁蓉属共有。这些序列使用ClustalW2 (v.2.0.12)程序进行提取和对齐，选项为“-type = DNA -gapopen = 10 -gapext = 2” [50]。使用EMBOSS包中的distmat程序实现的K2p进化模型计算了两两之间的距离差异。

6、选择性压力分析

使用Hyphy进行选择性压力分析。我们使用RevTrans v2.0 将18个编码蛋白质的DNA序列进行比对，比对采用CLUSTALW2选项进行。使用PAML v4.9中的yn00程序，采用F3X4密码子模型计算18个编码蛋白质的非同义替换率 (dN) 和同义替换率 (dS)。共有PCGs构建的ML树被用作input树。

7、系统发育分析

使用ClustalW程序对本文肉苁蓉属及其它36种列当科物种（详见表S1）的共有叶绿体编码基因序列进行比对。使用拟南芥和烟草作为外类群，采用RAxML构建最大似然树。详细参数为“raxmlHPC-PTHREADS-SSE3 -fa -N 1000 –m PROT-GAMMACPREV/GTRGAMMA— × 551,314,260 -p 551,314,260 -o Arabidopsis_thaliana, Nicotiana_taba- cum -T 20”。通过1000次bootstrap评估系统发育树的显著性，并在每个节点显示每个支持值。

8、分子钟分析

我们使用软件BEAST 对共有叶绿体基因组的PCGs序列进行分子钟分析，使用A. thaliana和N. tabacum的化石信息，以及cpREW氨基酸置换模型来分析叶绿体数据。采用严格分子钟方法进行MCMC分析推断物种树（20,000,000次MCMC迭代）。使用TRACER软件检查树是否收敛到稳态分布.使用FigTree软件（v. 1.4.3）可视化生成的树。

9、使用EcoPrimer识别DNA条形码标记

我们使用EcoPrimer软件基于完整的叶绿体基因组序列鉴定DNA条形码标记。为了实现这一点，我们下载了C. phelypaea叶绿体基因组并将其与本研究中获得的四个肉苁蓉属叶绿体基因组序列一起分析。使用命令“ecoPCRFormat.py -g -n Cistanche.Fo -t Taxonomy Cistanche.gb”构建数据集。随后，在构建的数据集上运行命令“ecoPrimer -d Cistanche.Fo -l 100 -L 1000 -e 0 -t species > Cistanche.Po”以查找每个DNA条形码标记的特定引物。

利用从可变的基因间区识别的标记和 EcoPrimer 设计引物区分四个肉苁蓉物种

使用 Snapgene 6.0设计了用于区分研究中的四个肉苁蓉物种的引物，或者是使用 EcoPrimer 软件选择的条形码区域的引物（表 S7 和 S8）。使用引物，PCR 扩增后在 ABI 3730 XL 仪器（Applied Biosystems，USA）上进行双向 Sanger 测序。

主要结果

1、肉苁蓉质体测序及组装

利用 Illumina 测序技术对肉苁蓉属（Cistanche） 叶绿体进行测序和组装，将测序数据映射到已经组装的叶绿体上，得到平均覆盖深度为 100-300 X (图 S1)。四个叶绿体为典型的圆形四分体结构，表现出很高的保守性（在图 S2 中总结）。四分体结构由一个大单拷贝区（32,470-52,005 bp）和一个小单拷贝区（398-29,719 bp）组成，两个IR区（6,593-30,352 bp）分隔开来（表 S1）。图 S3-S6 展示了 C. deserticola、C. salsa、C. tubulosa 和 C. sinensis 叶绿体的图示展示。C. deserticola、C. salsa、C. sinensis 和 C. tubulosa 叶绿体的大小分别为 109,454 bp、111,690 bp、111,500 bp 和 75,735 bp（表 S1）。C. deserticola、C. salsa、C. sinensis 和 C. tubulosa 叶绿体的总 GC 含量分别为 36.27%、36.11%、36.75% 和 34.95%（表 S1）。一般来说，小单拷贝区的 GC 含量低于大单拷贝区和倒置重复区，但 C. tubulosa 的情况例外。五个叶绿体的基因内容列在表 S1 中。计算了包括蛋白质编码基因 (PCGs)、假定的假基因、tRNA 基因和rRNA基因在内的所有基因的数量，以及可能缺失的基因（表 S1）。总体而言，29-44 个蛋白质编码基因可能已经丢失。这些数字与这些叶绿体中鉴定出的蛋白质编码基因的数量相似，表明肉苁蓉属（Cistanche）叶绿体中基因丢失和基因侵蚀的规模较大。与其它列当花科植物的叶绿体基因组相比，肉苁蓉属（Cistanche）叶绿体基因组的SSC（small single copy）区域明显缩小，长度范围仅为27bp到61,091bp长（见图1A和表S2）。相比之下，IR（inverted repeat）区域显著扩张，长度范围为2,318bp到45,796bp，而其他15种列当花科植物的IR区域长度均大于25kb（表S1和表S2）。值得注意的是，C. deserticola（398 bp）和C. salsa（435 bp）的SSC区域非常短，只包含rpl32基因（图1B）。C. tubulosa的SSC区域最长，约为29,719 bp。包括ycf2、ycf15、rps7、rps12、rpl23、rpl32、ycf1和rps15在内的八个PCGs位于C. tubulosa的SSC区域中（表格S4）。这些观察结果表明，肉苁蓉属（Cistanche）的SSC区域是基因丢失、假基因化和重排的热点（图S10）。SSC区域的大小变异主要是由于ndh、rps和ycf基因的丢失和假基因化所导致（表格S3）。此外，Cistanche叶绿体基因组的IR/LSC和IR/SSC交界处由于IR的扩张/收缩而高度变异（图2）。C. deserticola和C. salsa的LSC/IRa（IRb）区域交界处高度保守，rpl32基因位于SSC区域（表格S4）。但rpl32基因与边界的距离有所不同（图2）。与C. tubulosa相比，C. salsa和C. deserticola的rpl32和rps15基因的顺序相反。另一个有趣的观察结果是，ycf1基因在C. sinensis和C. phelypea的IRb和SSC区域都有分布（图2）。如图S7所示，这些Cistanche物种的叶绿体基因组较不保守。许多基因缺失，包括rpoA、rpoB、rpoC、rpoC2、psaB、psaD、psaI、petA、petB、petD、cemA等（表1和表格S5）。此外，与C. deserticola相比，在C. salsa、C. sinensis、C. phelypaea和C. tubulosa的叶绿体基因组中识别出了一些大的倒位（图S8）。而与非寄生的R. glutinosa相比，五个Cistanche物种的基因丢失程度不同（图S9）。

Fig.1 36个列当科植物质体SSC区域的变异。A） GS、LSC、SSC和IR区域的长度绘制在ML树的右侧。B） SSC区域的蛋白质编码基因。SSC区域的示意图绘制在ML树的右侧。

Fig.2 5个肉苁蓉属植物IR区收缩和扩张分析

表.1 5个肉苁蓉属植物基因内容统计

2、SSC区域收缩和IR区域扩张伴随着基因缺失和假基因化

我们以拟南芥和烟草为外类群，基于34个列当科物种基因缺失和假基因的比率构建了一个分层聚类树（图3）。列当科包括Orobanche，Cistanche或Phacellanthus等9个属。与拟南芥相比，除地黄外，大多数列当科物种的质体中都存在基因缺失（附表S5）。值得注意的是，列当科物种的叶绿体基因组具有较高比例的基因缺失，范围在41.25％至75％之间。缺失的基因主要集中在光合作用和能量生产基因上，如ndh或atp基因。在Cistanche叶绿体基因组中，C. phelypaea和C. tubulosa具有最高的基因缺失百分比，而C. deserticola和C. salsa具有最低的基因缺失百分比（图3A，表1和附表S5）。

Fig.3 36种列当科植物的推断基因缺失和假基因化。树的分枝长度与丢失基因或假基因的最大数量成比例。热图是丢失基因与假基因的比例。使用树状图进行分层聚类树。A） 基于基因丢失率的分层聚类树。B） 基于假基因比例的分层聚类树

所有Pedicularis ishidoyana，Orobanche austrohispanica，O. densifora，O. pancicii，O. rapum genistae，Lindenbergia philippensis，Rehmannia glutinosa和R. solanifolia的质体基因都具有功能。假基因最为常见于Lathraea squamaria和Aphyllon californicum，其百分比分别为41.25％和37.5％。在Cistanche叶绿体基因组中，假基因的比例从0.16到0.29不等，排序为C. tubulosa（0.16），C. sinensis（0.19），C. deserticola（0.23），C. phelypaea（0.28）和C. salsa（0.29）（图3B和附表S6）。Cistanche物种中的大多数光合作用和能量生产基因都是假基因，包括ndh，psa，psb，rps，rpl基因（附表S6）。

3、肉苁蓉属（Cistanche）叶绿体基因组中PCG的核苷酸替换率

dN / dS比值（ω = dN / dS）和aBSREL模型分析通过检查相关物种之间的多样化选择过程，提供了对基因进化的全面理解。总体而言，肉苁蓉属（Cistanche）的叶绿体基因组的替换率较低，表明叶绿体基因高度保守。然而，我们在ycf2基因中检测到正选择的信号（C. deserticola ω = 1.24; C. salsa ω = 1.22; C. tubulosa ω = 1.17; C. sinensis ω = 1.10和C. phelypaea ω = 1.12），以及C. phelypaea和C. salsa中chpP和rpl22基因的正选择信号（Fig. 4，Table 2）。其他PCGs主要具有同义替换，其中rps4基因显示出最高的同义替换率（ω = 0.11）（Fig. 4）。

Fig.4 5个肉苁蓉种内各保留质体基因间d N / d S值的两两箱线图

4、肉苁蓉物种的系统发育分析和分歧时间估计

我们使用36个列当科物种的共有PCGs（表S2，图S11）和最大似然（ML）方法构建物种系统发育树，然后使用BEAST校准拟南芥-烟草的化石记录数据（图S12）。在这里测试的肉苁蓉物种表现出单系起源，支持值较低（BS：66），分布在三个主要支系中，以沙苁蓉（C.sinensis）为基部物种/支系（图S11）。第二个支系包含肉苁蓉（C.deserticola）和盐生肉苁蓉（C.salsa）（BS：100）（图S11），它们具有相似的质体结构（表S1）。第三个支系包含C.tubulosa和C.phelypaea（BS：100）（图S11），它们的SSC区域具有相似的长度和组成（表S1，表S4）。在这一初步的ML系统发育重建之后，建立了分歧时间，以碎米蕨叶马先蒿（Pedicularis cheilanthifolia）作为列当科的根物种，分歧时间估计为1.55亿年前（Mya）（图S12）。肉苁蓉属的单系群大约分歧于约95.7 Mya，肉苁蓉在约77.3 Mya分裂，其余的肉苁蓉物种支系分离约45.2Mya。C. tubulosa and C. phelypaea之间的分裂大约发生在22.9 Mya左右，而肉苁蓉（C.deserticola）和盐生肉苁蓉（C.salsa）相对较年轻；它们的分裂估计约为12.3 Mya（图S12）。

表.2 肉苁蓉属中的阳性选择基因

5、鉴定肉苁蓉属植物高变异的基因间区域

为了确定开发肉苁蓉属植物种特异性分子标记的最适区域，我们利用同源基因间区域的Kimura 双参数距离（使用EMBOSS包中的dismat脚本）来计算基因间区域的变异程度（图5A）。在五个叶绿体基因组中，最具变异性的基因间区域包括clpP-rps11 (40.62)、rpl33-rps18 (14.97)、infA-rps8 (14.64)、rpl36-infA (14.38)、rpl16-rps3 (12.81) 和rps18-rpl20 (10.18)（图5A）。

图5.肉苁蓉属物种间高变间隔区的鉴定及Cis - mk01和Cis - mk02 DNA条形码标记的验证

6、开发和验证肉苁蓉属分子标记的方法

我们从先前鉴定的高变异的基因间隔区域（IGS）中选择了一个，即trnR-ACG-trnN-GUU，开发了两个DNA条形码标记，分别命名为Cis-mk01和Cis-mk02，并列出设计的引物（详见表S7）。将这些标记通过PCR扩增所有四个肉苁蓉属植物的总DNA（图S13）。每个PCR产物的序列分析允许鉴定出标记Cis-mk01具有九个特定的SNP位点和三个Indel位点（图5B），而标记Cis-mk02具有十四个特定的SNP位点和三个Indel位点（图5C）。这些SNP和indel成功地区分了所有四个肉苁蓉属植物的物种。

如介绍中所述，叶绿体基因组中高变异区域可以用于DNA条形码标记的开发。在本研究中，我们使用EcoPrimer软件鉴定这些高变异区域作为物种特异的DNA条形码，并为每个区域设计了一对引物，以准确鉴定每个肉苁蓉属物种（表S7）。经过验证，共有11个条形码区域（图6和S14），其中Cis-mk03显示出15个特异性SNP位点（图6A），Cis-mk04显示出14个特异性SNP位点（图6B），能够成功区分本研究使用的所有四个肉苁蓉属物种。另外的九个条形码区域见图S15。

图6.对Cis - mk03和Cis - mk04进行验证，发现其能够区分肉苁蓉属物种。

7、肉苁蓉属植物叶绿体基因组的大型结构变异

大部分陆地植物的叶绿体基因组在基因组结构、基因顺序、基因内容等方面都非常保守。植物叶绿体基因组通常长度在115-165 kb之间，具有典型的四分体结构，编码105-135个基因，包括70-90个蛋白编码基因、8个rRNA基因和30-40个tRNA基因，这些基因通常位于LSC或SSC区域（约有15-20个基因位于IR区域）。在我们的研究中，我们发现所研究的四种肉苁蓉属植物的叶绿体基因组大小较小（小于115 kb），编码的基因数量也较少。这些观察结果与肉苁蓉属植物的寄生生活方式相一致。由于它们从寄主的根或茎中获得碳、水以及其他营养物质，这意味着这些植物不需要光合作用能力，它们的叶绿体基因组易于减少基因而不影响其生存能力。先前的研究表明，五个肉苁蓉属植物的结构相似性相对较高。然而，我们的研究结果表明，所研究的肉苁蓉属植物的IR区域在不同程度上收缩和扩张。其中，肉苁蓉（C.deserticola）和盐生肉苁蓉（C.salsa）的IR区域扩张得非常剧烈（最多达到30,352 bp），而Cistanche tubulosa的IR区域则大幅收缩（至6,593 bp）。值得注意的是，在所研究的肉苁蓉属植物中，除了管状肉苁蓉外，四个rRNA基因（rrn16、rrn23、rrn4.5和rrn5）在IR中被复制。在管状肉苁蓉中，这四个rRNA基因位于SSC区域的单个拷贝中，解释了其相对较长的SSC和较短的IR（参见图S5）。此外，作为叶绿体基因组中最保守的区域，IR区的急剧收缩表明C. tubulosa经历了更加强烈的基因丢失，这也反映在其叶绿体基因组大小上（C. tubulosa，75,375 bp），是研究中五个物种中最小的一个。我们推测，这可能是由于肉苁蓉属物种生长环境的巨大差异导致了它们之间叶绿体基因组结构的显着差异。

8、肉苁蓉属叶绿体基因组的广泛基因丢失和假基因化

与超过7372个完全测序的陆地植物叶绿体相比，非光合植物的完全测序叶绿体数量非常少（截至本研究结束时约为100个）。到目前为止，仅报道了一些全寄生植物的叶绿体基因组，如列当科中的一些物种，菟丝子和水晶兰属等。在本研究中，我们测序了四个肉苁蓉属植物的叶绿体基因组，这是列当科中的寄生植物，与其他非寄生植物的系统基因组比较将进一步提供对寄生植物叶绿体进化的见解。

在四个新的肉苁蓉属叶绿体基因组中，所有与光合作用和能量生产有关的基因均已经假基因化或丢失，这与肉苁蓉属植物的全寄生和异养生活方式相一致。所有的ndh基因都缺失或假基因化，缺失基因的比例高于假基因化的基因。叶绿体ndh基因编码尼古酰胺腺嘌呤-质体醌氧化还原酶复合物的亚基，被认为是减少光氧化应激的关键基因，当光强度超过光合器官的容量时，会产生有害的活性氧物质，导致光氧化应激的发生。Convovulaceae科内的全寄生植物Cuscuta refexa的叶绿体基因组似乎完整，但所有的ndh基因都已丢失，而atp、pet、psa和psb基因要么丢失，要么假基因化。在该物种中，假基因的比例高于丢失的基因。其他寄生物种也有atp、pet、psa和psb基因缺失或假基因化。因此，肉苁蓉属中基因丢失和假基因化的现象应该是他们适应生活方式和环境所必需的简化和缩小叶绿体基因组的原因，这与其他寄生植物的共同特征相似。

9、两个物种的争议-肉苁蓉（C.deserticola）和盐生肉苁蓉（C.salsa）

对于肉苁蓉属的两个物种—C. deserticola andC. salsa，是否应视为两个不同的物种存在争议。以往的研究表明，肉苁蓉（C.deserticola）的化学成分和药理活性与盐生肉苁蓉（C.salsa）非常相似，并且在中国宁夏和甘肃省被用作当地的药用植物。这可能表明这两个物种实际上只是一个物种。我们的研究结果显示，肉苁蓉和盐生肉苁蓉的叶绿体基因组结构、长度和组成非常相似（肉苁蓉为109,454 bp，GC含量为36.27%；盐生肉苁蓉（C.salsa）肉苁蓉为111,690 bp，GC含量为36.11%，详见表S1）。两个物种的典型四个区域（LSC、IR、SSC）的长度也非常相似，包括极短的SSC区域即将消失。最大似然系统发育树显示，肉苁蓉（C.deserticola）和盐生肉苁蓉（C.salsa）作为一个单独的群体聚集在其他肉苁蓉物种之外（见图S11）。此外，通过野外调查，我们发现肉苁蓉（C.deserticola）和盐生肉苁蓉（C.salsa）具有相同的生长环境，但在自然界中储量更大。因此，我们建议将这两个物种视为一个物种。盐生肉苁蓉（C.salsa）可能被用作中国药典中的肉苁蓉草药，以解决资源短缺的紧迫问题。

结论

我们对五个肉苁蓉属植物的叶绿体基因组进行了比较分析，显示由于基因缺失和假基因化引起的结构变异，主要影响光合基因。这些肉苁蓉属植物的基因组大小比其他被子植物要小。特别是，肉苁蓉（C.deserticola）和盐生肉苁蓉（C.salsa）历了显著的 SSC 缩小和 IR 扩展，而C. tubulosa经历了 SSC 扩展和 IR 缩小。系统发育关系表明，肉苁蓉属是一个单系群，成立于大约 95.7 百万年前，其中肉苁蓉（C.deserticola）和盐生肉苁蓉（C.salsa）是已认可的两个物种。物种间的序列变异允许开发两个 DNA 条形码标记，Cis-mk01 和 Cis-mk02，以及在高度分化的非编码区域中开发的十一个 DNA 条形码标记（Cis-mk03 至 Cis-mk13），可以区分来自中国的肉苁蓉属植物物种。这些结果可以改进我们对肉苁蓉属的分类系统、叶绿体基因组演化以及来自肉苁蓉属植物的药用产品的鉴别理解。

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