牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)是中国特有的灌木花卉，染色体数目为2n=10。本研究使用了228个来自四个不同种群(江南、日本、西北和中原)的牡丹品种作为材料，探索了不同种群牡丹品种之间的遗传多样性水平。结果显示，使用5对cpSSR引物可扩增34条带型，每对引物平均扩增6.8条带型。不同等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、香农信息指数(I)、多样性(H)和多态信息含量(PIC)的平均值分别为3.600、2.053、0.708、0.433和0.388。PIC值在0.250到0.500之间，表明这5对cpSSR引物具有中等水平的多态性。不同种群的牡丹品种遗传多样性水平有所差异，其中西北种群相对较低(I=0.590，H=0.289，PIC=0.263)。在4个检测种群中共鉴定出52个单倍型，每个种群的单倍型数量范围从11到22个不等。在种群间检测到44个独特单倍型（private haplotypes），西北种群拥有最多的17个独特单倍型。有效单倍型数(Neh)、单倍型丰富度(Rh)和多样性(H)的平均值分别为8.351、6.824和0.893。分子变异分析表明，牡丹种质资源内部的遗传变异大于种质资源间的变异，主要变异存在于种质资源个体内部。聚类分析、主坐标分析和遗传结构分析将不同来源的牡丹划分为两大类群，表明这四个栽培种群之间存在一定程度的遗传分化。本研究为探索、利用和保护牡丹种质资源，以及优良品种育种研究提供了理论基础。
利用叶绿体DNA简单重复序列(cpSSRs)研究牡丹的遗传多样性和种群遗传结构Genetic diversity and population genetic structure of Paeonia suffruticosa by chloroplast DNA simple sequence repeats (cpSSRs)时间：2024 杂志：Horticultural Plant Journal 影响因子：5.7 分区：1/1区研究收集了来自河南科技大学(112°28'36.34"E， 34°39'30.34"N)的牡丹种质资源圃共228个样品。这些样品代表了中国江南、西北、中原和日本种群，其中江南11个样品、日本19个样品、西北64个样品和中原134个样品。采用Super Plant Genomic DNA Kit试剂盒(富含多糖和多酚类)提取DNA。收集的牡丹基因型的幼叶作为提取材料。通过1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA质量，使用NanoDrop 2000 UV-Vis分光光度计(Thermo Fisher Scientific， Wilmington， DE， USA)测定DNA浓度。对所有样品的DNA浓度进行了标准化处理。采用荧光标记的M13引物来标记和检测多态性。PCR扩增反应体系为10μL，含约20ng·μL-1基因组DNA。反应体系包括2μL DNA(20ng·μL-1)、5μL 2×Taq Plus Master Mix II(Dye Plus)、1.6μL ddH2O和0.6μL M13引物(10μmol·L-1)。正反向5对cpSSR引物分别加入0.2μL(10μmol·L-1)和0.6μL(10μmol·L-1)。PCR反应在BIO-RAD T100热循环仪上进行，每个cpSSR标记的扩增程序参照Guo等(2022)的方法。PCR产物在当天下午之前存放于-20°C冰箱中。产物的分离采用Applied Biosystems的ABI 3730XL DNA毛细管电泳分析仪。对228个样品中每个cpSSR位点，利用GenAlEx软件计算遗传多样性参数，如不同等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、香农信息指数(I)和多样性(H)。进一步利用cpSSR标记的基因型数据进行主坐标分析(PCoA)，检测种群内和种群间的差异。利用PowerMarker软件计算多态信息含量(PIC)。利用Haplotype Analysis软件计算单倍型数(A)、独特单倍型数(P)、有效单倍型数(Neh)、单倍型丰富度(Rh)、多样性(H)和个体间平均遗传距离(D2sh)。采用基于贝叶斯模型的聚类算法STRUCTURE软件包，根据5个cpSSR标记估计种群遗传结构。本研究对每个K值(K=1-10)进行了10次独立运行，10000次迭代，马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)重复10000次。其余参数设置为默认值。利用Earl和Vonholdt(2012)提出的ΔK模型，使用Structure Harvester(https://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)确定最优K值。 1、牡丹种质资源中叶绿体简单重复序列(cpSSR)标记的表征在最初测试的12个标记中，成功扩增了5个cpSSR标记(表1)。使用这5对cpSSR引物，共扩增了34条带型。每对引物扩增的带型数量范围为4-15条，平均每对cpSSR引物扩增6.8条带型。引物cpSSR-5扩增的带型最多，共15条，而引物cpSSR-19扩增的带型最少，仅4条(表2)。![]()
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等位基因多样性由Na表示，范围从2.000(cpSSR-23)到7.750(cpSSR-5)，所有位点的平均等位基因数为3.600。Ne的变化范围从1.020(cpSSR-23)到3.986(cpSSR-5)，平均值为2.053。反映遗传多样性的平均值为0.708.I。值得注意的是，cpSSR-23显示出最低值(0.052)，而cpSSR-5显示出最高值(1.525)。与上述变化一致，H和PIC也呈现出类似的模式。最低值出现在cpSSR-23(H和PIC均为0.043)，而最高值记录在cpSSR-5(H为0.798，PIC为0.770)。所有位点的平均H为0.433，平均PIC值为0.388(表3)。 ![]()
注意: Na:不同等位基因数; Ne:有效等位基因数; I:香农信息指数; H:多样性; PIC:多态信息含量。以下同理。日本种群表现出第二高的多样性水平，H值为0.427，PIC值为0.377。每个位点和种群的Na变化范围为1-11，Ne范围为1.000-6.333。H的范围为0.000-0.842，具体数值见表4。表4. 228个四个牡丹种群个体中5个多态性叶绿体微卫星标记的特征![]()
在4个检测的种群中，共鉴定出52个单倍型，占观测到的总单倍型的22.81%。每个种群的单倍型数量范围从11到22个不等。在这些单倍型中，数量有所不同，江南种群拥有11个单倍型，而西北种群拥有最多的22个单倍型。总的来说，在种群间检测到44个独特单倍型。在研究的种群中，西北种群拥有最多的独特单倍型数量。Neh范围从3.830到13.370，种群平均值为8.351。Rh范围从3.869到9.000，种群平均值为6.824。5个位点的H水平范围从0.744到0.982(表5)。D2sh变化更大，范围从62.677(西北种群)到225.256(江南种群)，平均值为151.945。图1展示了研究中228个基因分型牡丹样品的单倍型频率。大多数单倍型仅在一个个体中发现，在种群内呈现均匀分布。然而，也有一些单倍型在样品间共享。具体来说，5个单倍型(haplo-30、haplo-36、haplo-42、haplo-48、haplo-49)由两个样品共享，而一个单倍型(haplo-38)仅存在于一个样品中。另外，三个单倍型(haplo-24、haplo-44)分别由两个样品共享。 表5.基于5个多态性叶绿体微卫星标记的4个牡丹种群的单倍型多样性![]()
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图1 利用5个叶绿体SSR标记对228个牡丹基因型进行的单倍型频率分析
在图2所示的单倍型谱图中，有34个单倍型包含1个样品，8个单倍型包含2个样品。单倍型30包含最多的样品，包括1个来自日本种群和57个来自中原种群的样品。单倍型28位居第二，包括1个来自江南种群、2个来自日本种群、1个来自西北种群和34个来自中原种群的样品。共有8个共享单倍型，即单倍型18、28、30、36、42、44、48和49。 ![]()
图2. 利用中点连接法构建的cpDNA单倍型网络
棕色圆圈:江南种群的单倍型。粉色圆圈:日本种群的单倍型。蓝色圆圈:西北种群的单倍型。绿色圆圈:中原种群的单倍型。圆圈旁的数字是单倍型的序号。圆圈的大小对应单倍型的频率，圆圈越大表示该单倍型出现频率越高，圆圈越小表示该单倍型出现频率较低。线条代表连接长度。3、利用叶绿体SSR标记数据对牡丹种质资源的遗传结构分析采用STRUCTURE软件中实现的贝叶斯模型来研究牡丹的种群结构。分析结果显示，当K=2时，ΔK值最高，表明这是最可能的种群数目(图3，A，B)。第一类群包含了最多的个体(N=169，74.12%)，包括江南(N=3，27.27%)、日本(N=8，42.11%)、西北(N=60，93.75%)和中原(N=98，73.13%)的个体。两个类群的平均Q值非常相似，第一类群为0.980，第二类群为0.973。值得注意的是，大多数来自西北种群的个体被分配到第一类群，表明该地区存在明显的种群结构(图3，C)。相比之下，日本种群被均匀分布到两个亚群，没有显示出明显的种群结构(图3，C)。此外，基于非加权遗传距离的主坐标分析(PCoA)得到了一致的结果(图4;图5)，表明这四个牡丹栽培群体之间存在可辨的遗传分化水平。特别是西北种群表现出一定程度的遗传分化，而另外三个种群没有显示出高水平的遗传分化。 ![]()
图3.利用5个cpSSR标记对228个牡丹样品进行的STRUCTURE聚类
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图4.利用5个叶绿体SSR标记的基因分型数据对228个牡丹进行的主坐标分析(PCoA)
坐标轴1解释了52.57%的变异，坐标轴2解释了18.72%的变异。![]()
图5.利用5个叶绿体SSR标记的基因分型数据，基于主坐标分析的前两个坐标对牡丹的分布坐标轴1解释了71.65%的变异，坐标轴2解释了27.54%的变异。采用分子变异分析(AMOVA)评估种群间和种群内的变异。四个牡丹种群间的遗传变异率为26%，而种质资源内部的遗传变异率为74%。种质资源内部的遗传变异远大于种质资源间的变异，表明四个牡丹种质资源种群的遗传变异主要发生在种群个体内部(表6)。![]()
评估种质资源中各类样品的主要任务是确定它们在种质库中的遗传组成。随着分子技术的发展，利用基因组水平的遗传信息并与其他种质资源进行比较以分析遗传差异变得更加高效和科学。叶绿体SSR分子标记是一种新技术，结合了SSR和cpDNA的优势，使其更有可能应用于检测遗传变异。在本研究中，我们研究了来自江南、日本、西北和中原四个种群的228个栽培牡丹品种。利用cpSSR分子标记技术探究了不同种群中牡丹种质资源的遗传多样性。结果显示，使用5对cpSSR引物成功扩增了34条带型。平均每对引物产生6.8条带型，高于对13个种群76个紫牡丹（P. delavayi）个体的研究(3.5条带型)(Zhang等，2011)。我们的结果显示，平均Na为3.600，Ne为2.053，H为0.433，I为0.708。与其他木本植物相比，P牡丹的遗传多样性略低于茶藨子属(Ribes)植物(I=0.851)(Lācis等，2022)，但高于侧柏(I=0.673)(Cui等，2021)和柏科植物(I=0.589)(Huang等，2018)。本研究中PIC值范围为0.043-0.770，平均为0.388，与紫牡丹个体中6对cpSSR引物的结果相似(PIC=0.386)(Zhang等，2011)，但小于3个种群60个牡丹的结果(PIC=0.423)(Guo等，2022)。此外，PIC值介于0.25和0.5之间，表明这5对cpSSR引物具有中等水平的多态性。
随后，在不同种群中，牡丹品种的遗传多样性水平有所差异，西北种群表现出相对较低的水平(I=0.590，H=0.289，PIC=0.263)。这一结果与STRUCTURE分析一致，表明本研究中西北种群组样品的遗传基础较其他样品狭窄。日本种群中每个样品的基因流动信息与江南和中原种群相似，这与Yang等(2020)和Guo等(2018)的结果一致，表明日本种群样品是从中国引进的。对于样品量较大的西北和中原种群，中原组在两个类群中均有分布，并表现出最高的基因流动，表明其种源基础广泛、来源多样。这一结果与Zhou等(2014)的研究结果一致，表明在中国长期栽培历史中，杂交和自然选择形成了中原组丰富的遗传多样性。与中原组不同，西北种群表现出最低的遗传多样性水平，这可能是由于西北组品种历史较短(Yuan等，2014)。在未来的种质资源保护和管理中，加强西北种群与其他种群间的遗传交流对提高其遗传多样性水平很重要。本研究是利用cpSSR标记在牡丹种质资源研究领域进行的大规模调查，成功在228个材料中鉴定出52个不同的cpSSR单倍型。cpSSR标记的应用证明是分析牡丹种质资源的有价值工具，能够区分每个种群内的独特单倍型。值得注意的是，较小的种群显示出与其样品量相对应的单倍型数量，而西北种群表现出较高的遗传多样性，其64个样品中有17个具有独特的单倍型。这些发现增进了我们对牡丹品种复杂的遗传构成和多样性的理解。在其他植物物种的研究中，也观察到了单倍型多样性的有趣模式。例如，Götz等(2020)在1143棵树中利用cpSSR标记鉴定出29个独特单倍型。同样，Lācis等(2022)的研究表明，应用19个cpSSR位点能够在145个基因型中区分出112个不同的单倍型。这些发现凸显了cpSSR标记在阐明单倍型变异方面的有效性，以及在不同植物物种的遗传分析中的实用性。 叶绿体标记的多态性不如核DNA标记那么高，随着时间的推移，叶绿体标记在种内或种群水平上的分辨率可能会降低。这种较低的多态性是由于单亲遗传、缺乏重组、片段大小同源性和引物数量等因素造成的。本研究中发现的单倍型数量有限可能与片段大小同质性相关的遗传机制有关，这通常被认为是导致叶绿体片段分析多态性较低的一个因素。此外，与其他SSR标记类似，cpSSR标记数量较少也可能导致了这些结果。本研究使用的实验材料均为栽培的牡丹品种。尽管这些标记具有一定的区分能力，但种群内部结构仍不清楚。这是因为它们共享共同的祖先，这与主坐标分析结果一致，表明它们尚未形成独立的类群。因此，为进一步确定栽培牡丹品种的遗传组成，后续研究有必要结合其他类型的标记，以提高分析的准确性和广度，从而更好地服务于牡丹育种和种质资源收集管理。总之，本研究利用cpSSR标记评估了牡丹种质资源。结果显示，来自不同来源的牡丹品种表现出中等水平的遗传多样性。cpSSR标记对栽培牡丹品种具有一定的区分能力，适合用于种质资源收集分析和多样育种材料的选择。简而言之，本研究在母系遗传水平上确认了不同牡丹品种之间的多样性水平和遗传关系，为未来引进和制定种质资源保护策略提供了重要信息。 1、惠通生物针对叶绿体、线粒体测序项目组装结果准确，可以提供定制化高级分析，欢迎联系我们获取小基因组文章专业解决方案，助力文章发表。
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