Euphorbiae Humifusae Herba，简称EHH,具有药用和食用价值，但经常被掺杂其近缘种。因此，本研究旨在通过综合方法来鉴定EHH，包括形态学评估、HPLC分析、比较质体基因组分析和等位基因特异性PCR鉴定。首先，总结了8种大戟亚属植物的形态特征。然后，HPLC分析显示18批EHH样品被掺假或不合格。此外，对这8种大戟亚属物种的质体基因组进行了分析。系统发育分析揭示了这8种大戟亚属物种之间的姐妹关系。通过单核苷酸多态性（SNPs）和插入缺失（InDels）分析，开发了等位基因特异性PCR鉴定方法。等位基因特异性PCR结果显示27批EHH样品被掺假，表明分子鉴定方法比其他使用的方法具有更高的灵敏度。本研究为EHH的合理使用和系统发育研究提供了参考。
八种大戟亚属植物的质体基因组比较分析和地锦草的系统鉴定Comparative plastomes of eight subgenus Chamaesyce plants and system authentication of Euphorbiae Humifusae Herba时间：2024 杂志：Food Chemistry 影响因子：8.5 分区：1区
收集了大戟亚属的八个物种（每个物种三批）。此外，从中国各地购买了45批干燥的地锦草药材。根据《中国植物志》和《江苏植物志》的形态描述，通过新鲜植物的形态特征对这些样品进行了鉴定。植物材料干燥后研磨成细粉（40目）。取粉末0.5 g，用25 mL 70%甲醇浸泡12-18小时，在室温下超声提取两次（每次30分钟）。提取物经0.22 μm微滤膜过滤后进行高效液相色谱（HPLC）分析。根据先前的报道，准备了8种标准品，包括异槲皮苷、鞣花酸、山奈酚苷、槲皮素、山奈酚、木犀草素、杨梅素和芹菜素（HPLC≧98%）。制备不同浓度的槲皮素进行线性分析，并按先前报道评估45批地锦草中槲皮素含量。 使用二极管阵列检测器（Thermo，UlitMate 3000）进行HPLC分析。色谱分析在30°C下使用Thermo Acclaim™120-C18柱（4.6 × 250 mm，5 μm），流速为0.8 mL/min。检测波长设置为360 nm，进样量为20 μL。流动相由溶剂A（0.2%甲酸，v/v）和溶剂B（甲醇）组成。梯度洗脱程序基于先前研究略作修改，如下：0-20分钟，30-35% B；20-45分钟，35-45% B；45-50分钟，50-65% B；50-55分钟，65-95% B。
样品按HPLC分析的制备方法准备。提取物稀释10倍。代谢物谱分析使用配备ESI源的三重四极杆飞行时间质谱仪X500B系统（AB SCIEX，Foster City，CA，USA），与UPLC系统（岛津30 A UPLC系统）耦合。UPLC分析时，将5 μL样品注入反相分析柱（Agilent Infinity LabPoroshell 120EC-C18，100 mm × 2.1 mm，1.9 μm粒径）。分离使用0.1%甲酸水溶液（溶剂A）和乙腈（溶剂B）进行。总运行时间为53分钟，流速为0.3 mL/min。柱温维持在40°C。流动相使用梯度洗脱：5%-10%乙腈（0-8分钟），10%-13%乙腈（8-24分钟），13%-15%乙腈（24-33分钟），15%-20%乙腈（33-43分钟），20%-30%乙腈（43-48分钟），30%-70%乙腈（48-53分钟），70%-5%乙腈（53-58分钟），5%乙腈（58-63分钟）。飞行时间（TOF）分析时，质谱仪在负离子ESI模式下操作，使用双喷雾源，TOF-MS和TOF-MS/MS扫描的质量扫描范围设置为m/z 60-1000。使用以下参数：离子喷雾电压，-4500 V；涡轮喷雾温度，550°C；气帘气，35 psi；雾化气，55°C；碰撞压力，-40 V；碰撞能量扩散，-20 V，-40 V和-60 V；去簇电位，60/-60 V；离子释放延迟，66.63；铁释放宽度，24.92。数据使用Peakview软件（版本1.2）进行分析。
分别从八种大戟亚属植物的新鲜叶片和45批地锦草粉末中，使用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法提取DNA。使用BioPhotometer Plus估算总DNA的质量和浓度。然后，将合格的DNA进行测序。质体基因组DNA测序在Illumina X Ten平台上进行，采用150 bp双端读长，每个物种获得>10 Gb的序列数据。原始数据通过FastQC质检，然后使用Trimmomatic v0.38去除低质量读段和接头以获得清洁读段。使用SPAdes 3.6.1组装cleandata，k-mer大小参数分别为55、105和127。使用Bandage软件手动校正组装结果，去除非质体基因组序列。以斑地锦草（E. maculata）质体基因组（GenBank登录号NC_052745）为参考，手动调整每个contig的方向和相对位置。使用GeSeq工具进行组装基因组注释，并以斑地锦草（NC_052745）质体基因组为参考，手动校正起始/终止密码子位置和内含子/外显子边界。使用tRNAscanSE默认设置进一步鉴定所有tRNA基因。最后，基于注释结果，使用在线程序OGDRAW绘制质体基因组图谱。使用在线软件PREP（植物RNA编辑预测）以默认设置预测质体基因组中蛋白质编码基因的潜在RNA编辑位点。使用Codonw 1.4.2软件分析蛋白质编码基因的相对同义密码子使用（RSCU）。使用MISA工具检测简单序列重复（SSRs），参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复的最小重复单位分别设为10、5、4、3、3和3。两个SSR之间被认为是复合SSR的最大序列长度为100 bp。使用REPuter分析正向重复、反向重复和回文重复，最小重复大小为30 bp，汉明距离为3。使用Tandem Repeats Finder（TRF）以默认参数识别串联重复。使用31个物种的质体基因组序列进行系统发育分析。其中，23个物种的质体基因组序列从NCBI获得，其他8个物种的质体基因组序列来自本研究。选择这些物种相同的蛋白质编码基因序列构建系统发育树。使用MAFFT程序进行序列比对，并手动检查和校正比对结果。使用最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）方法推断系统发育树，以虎皮楠、大叶虎皮楠和小叶黄杨为外群。ML分析使用RAxML（v. 8.0.20）软件，迭代1000次，使用JmodelTest2选择最佳拟合模型GTR。BI分析使用MrBayes v. 3.2.7软件，使用Modeltest-NG中的赤池信息准则（AIC）选择最佳拟合模型GTR + I + G。进行四个并行的马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）运行，运行200万代，每100代取样一次，初始25%的树被设置为舍弃作为预热。使用FigTree 1.4.3可视化树。使用IRscope程序分析质体基因组序列IR边界的收缩和扩张。使用在线程序MAFFT进行序列比对。使用mVISTA程序通过shuffle-LAGAN模型比较八个大戟亚属物种的质体基因组，以斑地锦的注释为参考。使用DnaSP v5.10软件评估基因序列和基因间区序列的核苷酸多样性（Pi）。然后，选择具有高Pi值的高变区作为等位基因特异性引物的候选区域。使用BioEdit v7.0.9.0的ClustalW对高变区的核苷酸序列进行比对。仔细检查比对区域序列，并搜索足够的单核苷酸多态性（SNPs）和插入或缺失（InDels）以使用Primer Premier 6.0（Singh等，1998）开发等位基因特异性引物。使用等位基因特异性聚合酶链反应（PCR）鉴定地锦草品种。反应在20 μL混合物中进行，包括10 μL Premix Taq（Takara），1 μL 10 pmol每个引物，1 μL DNA和7 μL ddH2O。扩增条件如下：95°C变性5分钟，然后进行26个循环，每个循环包括94°C 30秒，62°C 45秒，72°C 30秒，最后72°C延伸5分钟。在1.5-2%琼脂糖凝胶上可视化扩增片段。此外，使用等位基因特异性PCR引物对每个地锦草DNA进行端点PCR（30个循环）以检测掺假。 使用CFX Connect™实时PCR检测系统（BioRad，Hercules，CA，USA）进行定量实时PCR（qPCR），最终体积为20 μL。反应混合物包括10 μL 2× Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（Servicebio），10 ng DNA和10 pmol每个引物组，用PCR级水调整至最终体积20 μL。实验条件如下：95°C预变性2分钟，然后进行40个循环，每个循环包括95°C变性10秒，62°C退火45秒，72°C延伸20秒。从65°C到95°C获得熔解曲线，每步增加0.5°C。为评估DNA浓度（CDNA）与循环阈值（Ct）值之间的相关性，将八个大戟亚属植物的基因组DNA十倍稀释成五个系列（0.001-10 ng）进行qPCR测定和回归分析。此外，含有目标物种（1 mg，0.1%；10 mg，1%；100 mg，10%；和1 g，100%）和非目标物种的参考二元混合物的基因组DNA稀释至最终浓度200 ng/μL，用于qPCR。使用线性回归方法计算标准曲线、相关系数（R2）和扩增效率。根据标准共线性方程确定Ct值的截止值（0.1%目标物种的Ct值）。从qPCR数据中删除差异Ct值大于1.5的数据。最后，将45批地锦草的DNA稀释至10 ng并用于qPCR。
收集的八种大戟亚属植物均为矮小的一年生草本植物。这些植物的形态非常相似，每种植物常常因生长环境和生长期的差异而表现出一些形态变化，这进一步增加了鉴定过程的复杂性。根据《中国植物志》和《江苏植物志》的形态描述，我们通过植物的果实和叶子准确鉴定了每个物种（图1）。具体的植物鉴定关键点已总结并列于附表中，这对于形态学鉴定非常有用。新鲜植物可以通过形态学鉴定，而干燥的草药往往已受损，无法准确鉴定。因此，寻找其他鉴定方法变得迫在眉睫。
为了进一步评估地锦草（EHH）的质量，对八种大戟亚属植物进行了HPLC分析。每个物种分析了三批样品，并选择了具有良好精度、重现性和稳定性的代表性色谱图。八种大戟亚属植物的色谱图存在差异（图2A）。小叶大戟（E. makinoi）和匍匐大戟（E. prostrata）的色谱图在峰信号分布上相似，但各信号的相对丰度不同（图2A）。相比之下，地锦草（E. humifusa）或斑地锦草（E. maculata）的色谱图与其他六种植物不同，并提供了分类结果。为了进一步说明八种大戟亚属植物的特征峰和化学成分，将它们的代表性特征色谱图与混合标准品进行比较。根据保留时间和最大吸收值，除了杨梅素外，七种标准品在所有八种植物中都找到了相应的峰（图2A）。地锦草或斑地锦的五个特征峰被鉴定并归因于异槲皮苷（峰2）、鞣花酸（峰3）、山奈酚苷（峰4）和槲皮素（峰5）。在小叶大戟和匍匐大戟中检测到对应于木犀草素（峰6）和芹菜素（峰8）的峰，而在飞扬草（E. hirta）中明显检测到杨梅素（峰1）（图2A）。 将45批地锦草（EHH）的色谱图与八个物种的代表性色谱图进行比较，以评估其真实性并检测任何掺假。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版）计算药材的相关系数。共有33批被鉴定为地锦草，相似度值为0.859-0.971。其中，30批（S1-S30）的色谱图与斑地锦草（E. maculata）一致（图S2A），3批（S31-33）与地锦草（E. humifusa）一致（图S2B）。然而，检测到12批存在掺假。S31-S38的色谱图虽然与斑地锦相似，但有额外的峰，这表明可能存在掺假（图2B）。值得注意的是，在S42-S45中观察到非常明显的差异，其中许多峰与地锦草或斑地锦都不重叠，因此产生了非常低的相似度值（表S6）。S43-S45几乎与小叶大戟（E. makinoi）一致（图2C），而S42与千根草（E. thymifolia）一致（图2D）。此外，构建了槲皮素的标准曲线（图S3），12批地锦草的槲皮素含量<0.1%（表S7）。总之，HPLC分析表明18批地锦草存在掺假或不合格。图2. 八种大戟亚属植物和45批地锦草的HPLC分析使用UPLC-QTOF-MS/MS对八种标准品和8种大戟亚属植物进行结构表征。标准品杨梅素、异槲皮苷、山奈酚苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚和芹菜素是黄酮类化合物，鞣花酸是有机酸。一般来说，黄酮类化合物在负离子模式下的MS强度优于正离子模式，特征碎片通过C环（中心三碳链）裂解、取代基和/或糖基的连续损失产生。以杨梅素为例，它在m/z 463.0862处显示[M-H]−离子，m/z 317.0278的苷元是由于失去一个中性鼠李糖基（146 Da）造成的（图S4）。作为含有-COOH官能团的有机酸，它们通常容易断裂产生小分子基团（Shen等，2023）。例如，鞣花酸在[M-H]−模式下的MS为m/z 300.9980，产生[M-H-H2O]−的MS/MS碎片离子，m/z为283.9957（图S5）。在本研究中，将样品在负离子模式下的保留时间和MS/MS碎片离子与参考标准品进行比较。结果显示，杨梅素仅存在于飞扬草中，而其他七种化合物（异槲皮苷、鞣花酸、山奈酚苷、槲皮素、山奈酚、木犀草素和芹菜素）在所有样品物种中都存在（图S4-S11；表S8）。这些结果与HPLC分析结果一致，进一步证明了HPLC分析方法的可靠性。八种大戟亚属植物质体基因组质控后的数据从82，984，602（千根草）到119，765，524（E. hirtas），所有数据都已存入NCBI数据库（SRA）。组装的质体基因组大小范围从162，727 bp（斑地锦）到164，981 bp（通奶草）。所有这些质体基因组都显示典型的四分体结构，包括一对反向重复（IR）区域（25，954–28，830 bp），由大单拷贝（LSC）区域（89，776–93，312 bp）和小单拷贝（SSC）区域（17，545–18，573 bp）分隔。这些质体基因组的整体GC含量相似（35.25%–35.42%），平均GC含量约为35.34%。然而，IR区域的GC含量略高（41.17%–42.36%），而LSC和SSC的GC含量略低（分别为32.28%–32.93%和29.39%–30.11%）。此外，rRNA基因的GC含量高于tRNA和蛋白质编码基因（PCGs）（表S9）。 所有质体基因组都拥有37个tRNA、8个rRNA和2个假基因。然而，PCG含量略有不同。通奶草和E. nutans的质体基因组分别拥有86个和82个PCG，而其余质体基因组拥有84个PCG（图3）。通奶草质体基因组IRa区域末端存在两个基因（rpl22和rps3），而E. nutans质体基因组IRa区域末端缺少两个基因（rpl2和rps19）。有18个基因包含一个内含子（匍匐大戟的atpF基因不含内含子），两个基因包含两个内含子（clpP1，ycf3），rps12基因是一个反式剪接基因（图3）。
RNA编辑是高等植物质体基因组中基因表达最重要的转录后调控方式之一，也可以提供创造转录和翻译多样性的有效方式。分析了大戟亚属质体基因组中蛋白质编码基因（PCGs）的RNA编辑位点，发现21个PCGs存在潜在的RNA编辑位点。大戟亚属质体基因组基因中预测的RNA编辑位点数量范围为50到53个。大部分RNA编辑位点位于相应密码子的第二位置，占约73%，没有RNA编辑位点位于第三位置。此外，丝氨酸(S)到亮氨酸(L)的转换频率最高，与其他高等植物类似。
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图3 大戟亚属质体基因组的基因图谱
重复序列在质体基因组的序列重组和变异中起重要作用。简单序列重复(SSRs)也是研究植物群体遗传学、进化和生态的重要分子标记。本研究对大戟亚属八个物种的质体基因组重复序列进行了比较分析。SSR比较分析显示，斑地锦和大地锦草具有最多的SSR类型（6种），而地锦草和小叶大戟最少（4种），其他物种为5种。此外，地锦草具有最多的SSR（128个），而E. hirtas最少（103个。但所有物种的SSR主要分布在LSC区域，其次是SSC区域。长重复序列(LRS)的比较分析中，只有斑地锦没有互补重复。此外，大地锦草具有最多的LRS（577个），而小叶大戟最少（202个），差异显著。密码子使用偏好对物种起源和进化、基因功能和蛋白质表达有重要影响，可用于研究分子水平上的进化过程。比较分析结果显示，所有物种的RSCU值非常相似，但可分为两个明显的分支。三个物种（E. hirtas、通奶草和大地锦草）形成一个分支，与其他五个物种明显不同，这与传统植物分类结果一致。不同物种的密码子总数不同，最高为通奶草（26835），最低为大地锦草（26143）。
我们进一步利用31个物种的81个共享蛋白质编码基因分析了大戟亚属样品的系统发育关系。结果显示，使用ML和BI方法生成的系统发育树拓扑结构高度相似（图4）。在这棵系统发育树上，所有大戟属物种形成一个支系，得到强烈支持。此外，大戟属的四个亚属形成四个明确的支系，与传统植物分类一致。我们还发现，飞扬草、通奶草和E. nutans形成一个支系，而大戟亚属的其他物种形成另一个支系。这表明E. hirtas、通奶草和大地锦草的系统发育关系比大戟亚属的其他物种更为密切，这与植物形态学差异的结果一致。图4 基于81个蛋白质编码基因，使用ML和BI方法构建的31个物种的系统发育树
反向重复（IR）区域的扩张和收缩是被子植物质体基因组长度变化的主要原因，在系统发育进化中起重要作用。因此，我们分析了大戟亚属质体基因组的IR边界。结果显示，除通奶草和E. nutans外，其他物种的IR区域扩张和收缩高度相似。为进一步研究它们的差异，使用mVISTA程序比较了大戟亚属物种的质体基因组。结果显示，非编码区比编码区更加多样化，LSC区域的差异性高于SSC和IR区域。此外，tRNA和rRNA基因极为保守，蛋白质编码基因相对相似，而高度分化的蛋白质编码基因包括accD、ycf1、ndhF和ycf2等。为进一步鉴定高变异区域，对编码区和非编码区进行了Pi分析。结果显示，编码区有14个基因的Pi值>0.01（图5A）。此外，非编码区有16个区域的Pi值>0.03（图5B）。这些Pi值高的区域表明存在多样性，因此是设计DNA条形码和等位基因特异性PCR引物的潜在区域。仔细检查后，最终选择了11个区域（trnE-UUC-trnT-GGU、trnS-GGA-rps4、ndhF-TrnL-UAG、accD、clpP、rpoA、ycf2、ycf1、ndhF、ccsA和rps15），具有足够的SNPs来区分这八个物种作为DNA条形码。设计了这些DNA条形码的通用引物，并成功用于PCR扩增八种大戟亚属植物。 图5 在八种大戟亚属植物中设计和评估等位基因特异性引物
仔细检查后，含有12 bp InDel的ndhF被认为是等位基因特异性PCR的最佳候选基因。所有等位基因特异性PCR引物的设计都基于两个或更多个SNP，以明确区分每个物种。设计并列出了两个等位基因特异性PCR引物（BD-ndhF和W-ndhF）。BD-ndhF引物的目标物种为地锦草和斑地锦，而W-ndhF引物用于其他六种大戟亚属物种。通过PCR评估了两个等位基因特异性PCR引物的特异性，并通过琼脂糖凝胶电泳可视化。只有地锦草和斑地锦的DNA模板才能被BD-ndhF引物扩增出PCR产物（图5C）。其他六个物种（飞扬草、千根草、通奶草、E. nutans、小叶大戟和匍匐大戟）明显检测到W-ndhF引物的条带（图5D）。这些发现表明，这两个等位基因特异性PCR引物可用于区分地锦草和斑地锦与其他六个物种。随后，分别用八种大戟亚属植物的10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng和0.001 ng DNA模板评估了这两个等位基因特异性PCR引物的灵敏度。BD-ndhF引物可扩增0.01 ng以上的地锦草和斑地锦草DNA。W-ndhF引物可成功扩增0.01 ng以上的其他六种大戟亚属植物DNA。本研究开发的两种等位基因特异性PCR方法对大戟亚属植物具有高灵敏度，检测限为0.01 ng。
为评估两个引物（BD-ndhF和W-ndhF）的适用性，将八种大戟亚属植物的基因组DNA进行qPCR测定。目标物种的熔解峰与非目标物种明显不同（图5E；图5G）。对于BD-ndhF引物，地锦草和斑地锦草有显著的高表达水平，而其他六个物种没有表达（图5F）。对于W-ndhF引物组，地锦草和斑地锦草没有表达，而其他六个物种有高表达水平（图5H）。通过使用八个物种植物的基因组DNA10倍系列稀释构建标准曲线，评估了两个引物的扩增效率。结果表明，目标物种中CDNA和Ct值之间存在强线性关系（图S20）。两个引物的相关系数（R2）高于0.99，斜率范围为-3.12至-3.69。扩增效率在86.64%至109.17%之间（表S18）。成功构建了参考二元混合物[0.1-100% (w/w)]的标准曲线（R2 > 0.98），表明这两个引物适合检测混合物中真品药材或掺假品的存在（图S21）。BD-ndhF引物对二元混合物的扩增效率为78.40-80.18%（表S19）。W-ndhF引物的标准曲线斜率范围为-3.169至-3.795，效率值为83.44%-106.82%。建立了Ct的截止值，以从校准曲线验证目标物种的存在。BD-ndhF引物的Ct截止值范围为27.20至29.31个循环，W-ndhF引物为28.01至35.64个循环（表S19，图S22）。BD-ndhF和W-ndhF引物组的最终截止值（F-Cts）分别确定为28.33和31.07。这些结果表明，设计的两个引物组具有高度敏感性和特异性，可以正确地鉴定复杂粉末中的目标物种。
使用两种开发的引物对45批地锦草进行了鉴定。18S rRNA引物的qPCR分析结果显示所有产品的Ct值较低（11.99-19.82），表明提取DNA的质量适合进一步测定。通过qPCR测定了45批地锦草的Ct值。在两个引物的应用中，共有22个样品高于F-Cts线，表明这些样品中几乎没有目标物种存在（图6A；图6B）。凝胶电泳证实，Gd1、Gx1、Gx3和Yn的DNA用BD-ndhF引物扩增失败，而用W-ndhF引物成功（图6C；图6D）。结合qPCR和HPLC分析结果，这四个样品肯定不是真品地锦草。共有27个样品被两种开发的引物扩增，表明这些样品被掺假（图6C；图6D）。PCR结果与qPCR结果完全一致，但检测到的掺假品明显多于HPLC分析测量的，表明等位基因特异性PCR方法的灵敏度非常高。 图6 45批地锦草的等位基因特异性PCR和qPCR
质体基因组大小在物种间有所变化，一般在120到208 kb之间，在被子植物中结构和基因内容高度保守。IR边界的收缩和扩张是质体基因组长度变化的主要原因，也是常见的进化事件。除了通奶草和E. nutans外，其他六种大戟亚属植物的质体基因组高度相似。通奶草的IR区域向LSC区域扩张了约1.5-2.3 kb，并包含了两个额外的基因(rpl22和rps3)，而E. nutans的IR区域收缩了约0.8-1.3 kb，缺失了两个基因(rpl2和rps19)。通奶草和E. nutans是外来物种，与其他六种大戟亚属植物的亲缘关系较远。这可能导致了它们质体基因组IR区域的差异。系统发育分析的结果进一步证实了通奶草和E. nutans与其他六个物种的远缘关系，这与传统分类一致。此外，质体基因组可以提高系统发育分析的分辨率，为解决大戟亚属植物群的系统发育关系提供了丰富的信息。 分子鉴定是一种更为便捷的检测方法。然而，许多操作方面仍需探索。PCR体系的建立是重要部分，包括DNA浓度、引物浓度和退火温度等，这些直接影响等位基因特异性PCR鉴定的准确性和特异性。分析一些关键因素后，我们发现PCR循环数对其特异性有显著影响。对于八种大戟亚属新鲜叶片的DNA样品，最佳循环数为26次。然而，考虑到DNA降解，干燥的地锦草药材可以通过PCR(30个循环)进行评估。此外，在两个引物的qPCR效率测定中，目标物种的检测限(LOD)均高于30(Ct)。qPCR分析广泛用于特定核苷酸的检测和定量。在本研究中，线性动态范围和扩增效率被用来评估两个引物的扩增效率和灵敏度，并建立可靠的qPCR分析方法。由于不到0.1%的非目标物种添加不被认为是出于非法经济利益的目的，因此将0.1%目标物种的Ct值确定为每个引物的临界值。掺假会影响设计的等位基因特异性引物的特异性和灵敏度。此外，引物对不同目标物种的特异性和灵敏度也有所不同。其中，W-ndhF引物对铺地大戟和小叶大戟的灵敏度低于其他六个物种。因此，如果掺假物种已经确认或只有一种，可以根据特定物种确定掺假鉴定的Ct值临界点。然而，综合考虑六种掺假物的影响，本研究选择平均Ct临界值作为F-Cts。F-Cts可以确定为一个标准值，是qPCR分析中大规模鉴定商业草药的有用和便捷工具。
形态鉴定是植物鉴定中最经典的方法之一，具有直观、快速和实用的优点。在本研究中，通过8种大戟亚属植物的特定植物鉴定关键，可以准确鉴定每种植物。然而，仅靠形态鉴定不足以鉴定这些物种，特别是对于干燥的草药或粉末。因此，形态鉴定可作为初步鉴定方法，应与其他鉴定方法结合使用。高效液相色谱（HPLC）分析已广泛用于中药材的物种鉴定和质量控制。整个色谱图可以系统地反映化学成分信息，并被定义为“化学条形码”以区分真伪。在本研究中，8种大戟亚属植物的HPLC色谱图具有高度可变的特征峰。因此，通过直接比较色谱图进行快速鉴定可以大大提高鉴定效率。HPLC分析是一种可量化的方法，可以通过统计分析有效评估质量）。根据《中国药典》，选择槲皮素的含量测定来反映地锦草药材的质量。因此，HPLC分析是地锦草药材质量控制的更好选择。
植物的化学成分复杂且易受环境和地理影响。因此，基于遗传信息的稳定性、高精度和特异性，分子鉴定已成为准确植物物种鉴定的有力工具。核糖体DNA的内部转录间隔区（ITS）已被用作系统发育和分子鉴定中的重要分子条形码。然而，基因区的双亲遗传可能导致多个单倍型序列。质体基因组是母系遗传，进化缓慢，具有足够的种间差异和低的种内变异，因此是设计等位基因特异性引物进行物种鉴定的更好目标。此外，高通用性结合位点可能会抑制种内和种间水平的物种鉴定，因此单个SNP位点通常不足以清楚地区分物种。一些基因，如matK、ndhF、ycf2和ccsA，比其他质体基因具有更高的SNP频率和插入缺失（Indels）。在本研究中，基于8种大戟亚属植物的质体基因组分析，选择了ndhF的12 bp InDel区域设计等位基因特异性引物，提供了足够的SNPs来区分地锦草和斑地锦草与其他六种植物。最终，开发并成功应用了一种新的地锦草药材分子鉴定方法。
基于HPLC分析的结果，只有12批地锦草药材被发现掺假，而通过等位基因特异性PCR鉴定发现有27批掺假。这不可避免地显示了等位基因特异性PCR鉴定方法相对于HPLC分析的优越性。等位基因特异性PCR鉴定提高了检测效率，可以在短时间内快速鉴定大量商业样品。此外，HPLC分析可以检测化学成分的含量，是质量控制的重要方法。在本研究中，通过HPLC分析和等位基因特异性PCR准确鉴定了45批地锦草药材。
总之，本研究通过结合形态学鉴定、HPLC分析、比较质体基因组分析和等位基因特异性PCR的数据，系统地鉴定了包括地锦草（E. humifusa）、斑地锦草（E. maculata）、小叶大戟（E. makinoi）、匍匐大戟（E. prostrata）、飞扬草（E. hirta）、通奶草（E. hypericifolia）、千根草（E. thymifolia）和E. nutans在内的8种大戟亚属植物。首先，建立了这8种大戟亚属植物的鉴定检索表，用于直观地鉴定新鲜植物。每种大戟亚属植物都有独特的HPLC色谱图。在HPLC分析中，约40%的45批地锦草药材样品不合格。然后，对这8种大戟亚属植物的质体基因组进行了测序和比较分析。基于ndhF基因的SNPs和InDels，开发了等位基因特异性PCR方法，并应用于45批地锦草药材的鉴定，结果发现27批样品存在掺假。本研究为8种大戟亚属植物提供了分子信息，可用于鉴定、分类学分类和进化分析目的。
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