线粒体基因组学分析为贻贝科的atp8基因缺失和适应性进化提供了新的见解

背景导读

     贻贝科（Mytilidae）也称为海洋贻贝，广泛分布于世界各地的海洋中。贻贝科的成员表现出巨大的生态适应性，从分布在淡水中的物种到栖息在深海的物种。线粒体在能量代谢中起着重要作用，可能有助于Mytilidae适应不同的环境。此外，一些双壳类物种被认为ATP8基因缺失。越来越多的研究表明，atp8基因的缺失可能是由于注释困难造成的，因为atp8基因的特点是高度分化，长度可变。

论文ID

Mitochondrial genomic analyses provide new insights into the “missing” atp8 and adaptive evolution of Mytilidae 

杂志：BMC Genomics  影响因子：4.547 发表时间：2022

摘要

结果：在本研究中，新组装了三种海洋贻贝（Xenostrobus securis、Bathy-modiolus puteoserpentis、Gigantidas vrijenhoeki）的完整线粒体基因组，长度分别为14972bp、20482和17786bp。在重新组装的三种贝类序列和被注释缺少atp8的已发表序列中注释到了atp8基因。新注释的atp8序列都有一个预测的跨膜结构域，一个类似的亲水性蛋白，以及带有带正电荷氨基酸的C端区域。此外，我们重建了系统发育树并进行了正选择分析。结果表明，深海动物经历了更宽松的进化约束。此外，在沼蛤的nad4中检测到阳性选择的信号，这可能有助于该物种在淡水中的生存和/或繁荣。

结论：我们的分析支持，在Mytilidae中可能没有缺失atp8。我们的结果提供了证据，线粒体基因可能有助于Mytilidae适应不同的环境。

线粒体是重要的真核细胞器，它们通过氧化磷酸化（OXPHOS）在ATP生产中发挥重要作用。动物的典型线粒体基因组是一个小的约（16kb）环状小分子，包括13个OXPHOS相关基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因，通常遵循严格的母体遗传。在双壳纲，如贻贝科，斧蛤科等一些物种中显示出独特的双单亲遗传（DUI）模型，即雄性（M型）和雌性（F型）线粒体基因组高度不同的（DNA差异超过20%）。贻贝科（Mytilidae）也称为海洋贻贝，广泛分布于世界各地的海洋中。贻贝科的成员表现出巨大的生态适应性，从分布在淡水中的物种到栖息在深海的物种。线粒体在能量代谢中起着重要作用，有助于贻贝科适应不同的环境。此外，一些双壳类物种被认为缺乏线粒体蛋白编码基因ATP合成酶F0亚基8。越来越多的研究表明，atp8的缺失可能是由于注释困难造成的，因为atp8基因的特点是高度分化，长度可变。atp8基因是否真的在某些物种中“缺失”，已经成为研究人员关注的问题。线粒体DNA是最有用的工具之一，广泛用于物种鉴定、物理遗传学研究、比较基因组学和外来入侵物种管理。贻贝科的Xenostrobus securis、沼蛤（Limnoperna fortunei）和紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）等被视为臭名昭著的入侵物种，对生态系统造成了巨大的破坏性影响。本研究中，重新组装了S. securis和两种深海贻贝（Bathymodiolus puteoserpentis，Gigantidas vrijenhoeki）的完整线粒体基因组。研究重新注释了Mytilidae中的atp8基因，旨在回答atp8是否在整个家族中缺失。此外，还对12个蛋白质编码基因进行了选择压力分析，目的是为贻贝科适应进化（适应不同环境：深海和淡水）的分子机制提供新的见解。

材料方法

1、研究数据

测序数据从NCBI（X. secures SRR7751554，B. puteoserpentis ERR3959529，G. vrijenhoeki SRR10802050）下载。这些物种的线粒体基因组用NOVOPlasty软件组装。MITOS用于注释线粒体基因组。

2、系统发育分析

本研究分析中只包括F型。46个序列的12个蛋白质编码基因用于重建系统发育关系。巨大牡蛎（AF177226.1）和牛角江珧蛤（KC153059.1）作为外类群（表1）。使用PAML4.9中的MCMCtree程序估计分化时间。

表1 本研究中用于系统发育分析的Mytilidae线粒体全基因组

3、正选择分析

比较非同义/同义核苷酸取代率（ω=dN/dS）已被广泛用于评估蛋白质编码基因的适应性分子进化。采用PAML4.9中的程序CODEML用于计算dN/dS的值。使用Mrbayes推断的12个蛋白质编码基因的系统发育树进行选择分析。

主要结果

1、三个贝类线粒体基因组一般特征

研究成功地获得了X. securis、B. puteoserpentis和G. vrijenhoeki的完整线粒体基因组，长度分别为14972bp、20482bp和17786bp。我们组装的基因组显示出与每个物种已知序列的高度相似性。碱基位置分析表明，三个组装的基因组偏向于A和T，组装的基因组都具有负AT偏斜和正GC偏斜的特征（表2）。碱基组成和偏度与双壳类的大多数研究一致。

表2 三种线粒体基因组的AT含量、GC含量和组成不对称性

对于这三个物种，所有基因都编码在重链（H链）上，除了轻链中的tRNA-Gly（L链）。每个基因组有13个蛋白质编码基因和2个核糖核酸基因（图1）。然而，tRNA的数量是不同的。对于这三个物种，蛋白质编码基因主要始于密码子ATG，终止密码子均为TAA或TAG，但S. securis的nad1和cox3具有不完整的T终止密码子。不完全的终止密码子被认为是通过转录物的聚腺苷酸化完成的。

图1 44个贻贝科物种的线性化线粒体基因排列模式。

2、ATP8注释

本研究中，我们对注释结果显示缺少atp8的序列手动注释，在基因间区域手动注释了12个atp8序列（表3）。不采用手动注释，注释不出来ATP8的主要原因可能是由于缺乏相关物种的atp8序列以及与已知atp8基因的低序列相似性。对于新注释的atp8，起始密码子是ATG或GTG或ATC，终止密码子是TAG或TAA。与一级序列相比，ATP8通常具有更高的二级结构保守性。新注释的atp8序列都有一个预测的跨膜结构域，类似的亲水性分布，以及带正电荷氨基酸（R、H和K）的C-末端区域。（表3，图2和图3）。

表3 贻贝科中atp8基因注释

图2 本研究中鉴定的候选atp8基因二级结构亲水性分布图

本研究中，贻贝科中atp8的长度短且可变，范围为37–139 aa（表3和图3）。梭子蟹的atp8序列远长于相关物种，作者并不确定这个序列是否使用了不完整的终止密码子（TA或T），从而导致了实际长度比当前长度短的事实。atp8基因的比对表明，atp8序列高度不同，仅在相关物种中表现出相似性。我们的研究结果表明，在贻贝科中可能没有缺失atp8基因，并提供了进一步的证据，证明一个家族拥有atp8基因。图3 贻贝科不同物种atp8基因比对

3、贻贝科内的系统发育关系

为了进一步研究贻贝科物种之间的关系，使用最大似然和贝叶斯推断方法，通过串联比对重建了系统发育树。这两种方法得出的树拓扑是一致的。结果支持贻贝科被细分为两个主要分支（图4）。分支1包括Bathymodiolinae亚科、Modiolinae族、Limnoperninae族和Lithophaginae族以及弧蛤亚科（Arcuatulinae），分支2包括Brachidontinae亚科、Mytilinae族、Crenellinae亚科、Septiferinae亚科和Arcuatula属。两个分支之间的估计分歧时间约为399.37 Mya（95%HPD区间392.74-407.65 Mya），这与其他分析中的估计时间接近（图5）。

图4 使用贝叶斯推断和最大似然方法，基于12个蛋白质编码基因的贻贝科物种的系统发育进化树

图5 MCMCtree推断贻贝科物种的分化时间

4、正选择分析

正选择已被广泛认为是影响线粒体基因组分子进化的主要力量。本研究使用One-ratio模型分析了这12个基因的ω值范围为0.0024至0.0435，其中cox1-3的ω值低于其他基因（表4）。所有的ω值都小于1，表明贻贝科的12个基因经历了受限的选择压力以维持其功能，贻贝科的成员表现出巨大的生态适应性。为了检测不同环境（淡水、深海和浅海）中的分支是否受到异质选择压力的影响，实施了Three-ratios模型分析。似然比模型表明，Three-ratios模型在cox1、atp6、cob、nad2和nad5（表4）的拟合度明显优于null模型，表明分支之间的选择压力存在差异。在深海分支中，除cox1外的那些基因的ω值高于其他分支，表明这些基因经历了正选择的放松。在许多研究中，包括深海海参等都发现了深海分支中正选择的放松，放松的正选择可能有利于深海物种适应极端环境中氧气水平和代谢率的降低。

表4 贻贝科分支模型分析为了确定正选择是否作用于淡水分支或深海分支中的几个位置，进行了分支位置模型分析。在深海分支中，atp6、cob、nad2、nad4、nad5和nad6被识别为阳性位点（>95%），但不显著。在淡水分支中，nad2、nad4和nad5被确定为阳性位点（>95%），只有nad4的p值是显著的，这意味着nad4可能有助于L. fortunei在淡水中的适应（表5）

表5 淡水分支的分支站点模型分析NADH脱氢酶成员的突变会改变代谢能力，进而影响器官功能的适应性。为了探讨阳性选择位点对nad4的可能影响，使用大肠杆菌结构作为模板生成了蛋白质模型。大多数阳性位点直接位于TMα7a中，其在氢离子运输中起着最重要的作用（图6a）。在TMα9末端附近发现一个阳性位点，该位点与位于TMα7a的阳性位点相邻。有趣的是，两个阳性位点都是极性氨基酸，这些取代可以改变TMα7a和TMα9之间的环境（图6b）。我们推测NADH脱氢酶的突变可能有助于这些物种在淡水中的生存和/或繁衍。

图6 nad4基因结构分析

结论

本研究组装了三种海洋贻贝（Xenostrobus securis、Bathyodollous puteoserpentis和Gigantidas vrijenhoeki）的线粒体基因组。在组装的三种贝类序列和缺少atp8的数据库已公布序列中注释到了atp8。新注释的atp8序列都有一个预测的跨膜结构域，一个类似的亲水性蛋白，以及带有带正电荷氨基酸的C端区域。研究结果支持，在贻贝科中可能没有缺失atp8。此外，重建了贻贝科的系统发育树，并进行了正选择分析。结果表明，深海动物经历了更宽松的进化约束。此外，在L. fortunei的nad4中检测到阳性选择的信号，这可能有助于该物种在淡水中的生存和/或繁衍。

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