通过检测中国南方13种油茶山茶属植物样本确定了油茶叶绿体DNA中的同义密码子使用(SCU)偏好，并利用GenBank序列信息进行生物信息学分析，结果显示这些样本之间存在保守的偏好。第三位置的GC含量(GC3)最低，偏好A或T，表明SCU偏好较弱。前两个密码子位置的GC含量(GC1和GC2)极显著相关，但与预期密码子数(ENC)无关。GC3与GC1和GC2无关，但与ENC极显著相关。在30个高频密码子中,分别有15、14、1和0个密码子第三位置为U、A、G和C。大多数基因的点分布在中性作图对角线上方。20个基因的点分布在或接近ENC作图标准曲线上,占所有编码序列(CDS)的37.74%,ENC比率在-0.05~0.05之间。但其他基因的点分布在标准曲线下方,ENC比率更高。大多数基因的点分布在PR2作图的下部分,尤其是右下角。筛选出28个高表达密码子,其中第三位碱基分别有11个U、9个A、7个C和1个G。通过比较高频密码子,筛选出20个最优密码子,其中第三位碱基分别有11个U、8个A、0个C和1个G。根据同义密码子使用偏好(RSCU)构建的系统发育树,所有样本被分为6个分支(r2=0.9190,d=0.5395)。高州油茶（Camellia gauchowensis）、越南油茶（C. vietnamensis）、海南未确定油茶种和香花油茶（C. osmantha）属于同一分支；高州油茶、越南油茶和未确定种的遗传关系最接近。总之,SCU偏好受选择作用影响,但突变的影响也不能忽视。由于不同物种的SCU偏好存在差异,可用于鉴定植物种类和推断遗传关系。例如,越南油茶和高州油茶可能是同一种,未确定种可能是越南油茶。本研究结果为研究叶绿体DNA基因表达和叶绿体DNA基因工程奠定了基础。
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中国南方13种油茶山茶属植物叶绿体基因组同义密码子使用偏好Synonymous Codon Usage Bias in the Chloroplast Genomes of 13 Oil-Tea Camellia Samples from South China时间：2023 杂志：Forests 影响因子：2.9 分区：1/2区用于叶绿体DNA测序的叶片样本来自各种植物,包括13个山茶属样本,其信息如表1所示。根据植物DNA测序后的数据拼接和比对,HD10~HD13样本(海南省3个未确定种和广东省徐闻县的高州油茶)的叶绿体DNA序列是相同的,都来自HD10的叶绿体DNA。因此,分析同义密码子使用偏好时使用了10个叶绿体DNA。基于对这10个叶绿体DNA的注释,并参考油茶(HD07，MN078090)的基因组,在删除长度小于300bp、重复基因和终止密码子后,筛选出53个有效的编码序列(CDS)用于分析同义密码子使用偏好。使用CUSP软件计算每个基因每个密码子第一、第二和第三位置的GC含量(分别为GC1、GC2和GC3),并确定每个基因每个密码子的总GC含量(GCall)和有效密码子数(ENC)值。ENC值范围为20到61,20表示极端偏好且每个氨基酸只使用一个密码子,61表示无偏好,每个氨基酸使用所有同义密码子。在R环境中进行线性相关性分析,双侧检验,**符号表示p≤0.01时极显著,*符号表示p≤0.05时显著。 RSCU = 一个密码子的观测频率/假设所有同义密码子对该氨基酸使用频率相等时的预期频率。使用CodonW软件计算RSCU,并用Microsoft Office Excel 2016软件绘制相应图形。基于每个同义密码子的RSCU,使用SAS中的cluster过程的单一方法进行聚类分析。中性作图主要用于识别影响SCU偏好的因素。GC3含量和GC12含量[GC12=(GC1+GC2)/2]分别为横纵坐标,每个点代表一个特定基因绘制二维散点图。如果点分布在对角线上,线性回归接近1,则GC12和GC3含量基本相同,即密码子不同位置的碱基组成几乎相同,表明该基因受选择压力影响较小,但受突变压力影响较大。如果点远离对角线分布,线性回归接近0,则GC12和GC3含量差异较大,即该基因主要受选择压力影响。ENC用于识别SCU偏好范围,预期值范围为20到61,值越接近20表示SCU偏好越受突变压力影响,否则越受选择压力影响。每个叶绿体DNA CDS中同义密码子第三位置的GC含量(GC3s)和实际ENC值(ENCcobs)分别为横纵坐标绘制二维散点图。根据公式ENCexp=2+GC3s+29/[GC3s2+(1-GC3s)2]绘制ENC预期值(ENCexp)曲线。然后根据每个CDS的GC3s含量计算其ENCexp,并根据公式ENCratio=(ENCexp-ENCcobs)/ENCexp计算ENC比率(ENCratio)。 PR2作图分析也称为等位偏好分析,揭示密码子第三位置4种碱基A、T、C和G的组合差异是否影响SCU偏好。本研究中,缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸和精氨酸这8种仅在第三位置有变化的简并密码子也用于PR2评估。G3s含量与G3s和C3s含量之和的比值为横坐标,A3s含量与A3s和T3s含量之和的比值为纵坐标,绘制二维散点图并分析。中心点表示碱基含量均匀,即A=T且C=G,说明没有等位偏好或突变,而从中心点出发的矢量表示碱基偏移的程度和方向。选择RSCU大于1的高频密码子,将53个CDS按ENC值从高到低排序,从最高和最低两端各选择10%的基因,确定高低表达基因组。对于每个密码子,计算高表达组的RSCU减去低表达组的RSCU,用ΔRSCU表示差值。如果一个密码子的ΔRSCU值不小于0.08,则视为高表达密码子;最终通过比较高频密码子和高表达密码子确定最优密码子。根据前期报告的方法获得65条完整叶绿体DNA序列,并加入10个样本序列进行分析。提取上述75条完整叶绿体DNA序列的CDS进行系统发育分析。通过IQ-TREE选择最优模式为GTR+invgamma。使用IQ-TREE构建系统发育树,外群设置为Hartia_laotica (NC_041509.1),IQ-TREE参数设置为-BB 1000和-ALRT 1000,表示核酸分子替代模型设置为GTR,位点间的速率变化由invgamma模型定义,先验概率模型参数设置为默认值,Markov参数设置为Nruns=2、Nchain=4、Ngen=1,000,000、Samplefreq=500和Temp=0.05,表示分析中的CDS同时运行。获得原始树结果后,删除与样本无关的分支,得到最终的系统发育树。从每个样本中筛选出相同的53个叶绿体DNA编码序列(CDS),这些CDS的碱基组成如表2所示。表2. 油茶山茶属植物叶绿体基因组中密码子在不同位置的GC含量和ENC值![]()
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所有样本的CDS包括27个光合作用基因、18个自我复制基因、4个其他基因和4个编码未知功能蛋白质的基因;其中accD基因编码乙酰辅酶A羧化酶的亚基,是脂肪酸合成的关键酶。分别检查所有样本发现,CDS在GC1、GC2、GC3和GCall含量以及ENC值方面存在差异。检查不同样本中相同的CDS显示,22个基因(atpA、atpE、atpI、cenA、clpP、ndhC、petA、petB、petD、psaB、psbC、psbD、rbcL、rpl14、rpl2、rpl22、rps12、rps14、rps3、rps4、rps7和ycf3)密码子的GC含量保持一致,占所有CDS的41.51%。7个基因(accD、ndhF、ndhK、rpoB、rpoC2、ycf1和ycf2)在每个密码子位置都存在差异,占所有CDS的13.21%。2个基因(ndhG和rps8)只在GC1含量存在差异。3个基因(ndhE、ndhI和rpl16)只在GC2含量存在差异。13个基因(atpB、atpF、ccsA、ndhA、ndhB、ndhD、ndhJ、psaA、psbB、rpl20、rps18、rps2和ycf4)只在GC3含量存在差异,占所有CDS的24.53%。matK和rpoC1基因在GC1和GC3含量存在差异。ndhH和rpoA基因在GC2和GC3含量存在差异。因此,不同密码子位置或CDS之间的GC含量存在差异,CDS之间的GC3含量差异很常见。此外,不同CDS的表达频率也不同。但是,在所有样本中,相同CDS的GC含量相同或仅略有差异,所有样本的平均GCall含量范围为37.42%至37.44%。这些结果表明,密码子的碱基组成偏好A或T,尤其是第三位碱基为A或T的密码子占绝大多数。因此,所有样本中所有CDS的碱基组成高度保守。 不同CDS的ENC值范围为35.23至56.67,不同样本的平均ENC值范围为48.48至48.51。由于ENC值超过35,所有样本的SCU偏好较弱。一些CDS在不同样本中表现出相同的ENC值,而一些样本具有相同的平均ENC值,表明样本之间在基因表达频率和SCU偏好方面存在保守性。当分析所有样本之间的差异时,HD03~HD08样本中的一些不同基因表现出GC含量的独特变异模式。例如,在博白大果油茶(C. gigantocarpa，HD03)的atpF和ndhJ基因的GC3含量、南山茶(C. semiserrata，HD06)的rpl16基因的GC2含量、rps11和rps18基因的GC3含量、油茶(C. oleifera，HD07)的ndhE基因的GC2含量、香花油茶(HD08)的ccsA、ndhD和基因的GC3含量等。其他样本在相应的GC含量上没有差异,表明存在物种特异性。高州油茶、越南油茶和海南未确定种(HD01、HD02、HD09和HD10)与油茶(HD07)在不同CDS的GC含量方面相似。特别是广州高州油茶、越南油茶和海南未确定种(HD01、HD09和HD10)彼此更为相似,而香花油茶(HD08)与高州油茶、越南油茶和海南未确定种(HD01、HD02、HD09和HD10)更为相似,而与其他样本的相似性较低。图1显示了所有样本之间GC1、GC2和GC3平均含量的比较。所有样本的GC1、GC2和GC3含量几乎没有差异。具体而言,GC1、GC2和GC3含量较低,分别低于50%、40%和30%,表明不同基因在所有样本中的表达频率不同,且密码子的碱基组成偏好A或T。最后,所有样本之间观察到遗传保守性。 ![]()
图1 不同样本叶绿体DNA中不同密码子位置的平均GC含量比较
表3显示了每个样本中所有密码子位点的GC含量、所有CDS的GCall含量和ENC值之间的线性相关分析结果。GC1和GC2、GCall和GC1、GC2、GC3、GCall和GC12、GC12和GC1或GC2之间存在极显著的线性相关性。然而,GC3与GC1、GC2和GC12的相关性不显著。这一结果表明,密码子第一位和第二位的碱基组成相似,但第三位与前两位明显不同。这与之前发现的第三位置偏好A或T的结果一致。ENC值与GC3含量极显著相关,但与GC1、GC2和GC12含量无关,表明密码子的第三位受SCU偏好的强烈影响。此外,这一发现与密码子第三位置强烈偏好A或T的结果一致。表3.油茶山茶属植物不同密码子位置的GC含量和ENC值的相关分析图2中的堆积条形图显示了所有叶绿体DNA样本的RSCU。所有不同样本的堆积条形状高度相似,表明所有样本的叶绿体DNA在遗传上高度保守。有30个RSCU值大于1的高频密码子：苯丙氨酸的UUU;亮氨酸的同义密码子UUA、CUU和UUG;异亮氨酸的AUU;缬氨酸的同义密码子GUA和GUU;酪氨酸的UAU;甘氨酸的同义密码子GGA和GGU;asparagine的AAU;谷氨酸的CAA;赖氨酸的AAA;天冬氨酸的GAU;谷氨酰胺的GAA;丝氨酸的同义密码子UCU、AGU和UCA;脯氨酸的同义密码子CCU和CCA;苏氨酸的同义密码子ACU和ACA;丙氨酸的同义密码子GCU和GCA;半胱氨酸的UGU;组氨酸的CAU;精氨酸的同义密码子AGA、CGA和CGU;以及终止密码子UAA。在这30个高频密码子中,第三位碱基为U、A和G的分别有15个、14个和1个,表明密码子的第三位置偏好A或U。否则,第三位碱基为G或C的密码子都是低频密码子,因为它们的RSCU值小于1。因此,密码子的第三位置偏好A或T。 图3显示了所有样本的中性作图。不同样本的图形高度相似,绝大多数点分布在相同位置,表明所有样本的叶绿体DNA在遗传上高度保守。所有样本53个CDS的GC3含量范围为19.12%-37.11%,53个CDS的平均GC12含量范围为32.00%-55.40%,表明密码子的第三位置与前两位置存在显著差异。只有cemA和ycf2基因的点几乎分布在对角线上,atpF基因的点极其接近对角线。因此,这三个基因的SCU偏好受突变压力影响。然而,其他50个基因的点分布在对角线上方且远离对角线,rps11基因的点距离对角线最远。所有这些基因的SCU偏好受选择压力影响。GC12含量对GC3含量的单位线性回归和决定系数范围分别为0.0768-0.1002和0.0032-0.0054,表明线性回归和相关关系不显著,所有样本中回归和相关系数的最大值和最小值分别来自南山油茶(HD06)和小果油茶(HD05)。所有这些结果表明,第三位置在数量上与前两位置存在显著差异,而绝大多数密码子的SCU偏好受选择压力影响。 图3. 油茶山茶属植物叶绿体基因组中密码子的中性作图分析图4显示了所有叶绿体DNA样本的ENC作图分析结果。所有样本的图形高度相似,大多数点分布在标准曲线的下方,表明所有叶绿体DNA样本在遗传上保守。clpP和ycf3两个基因的点几乎分布在标准曲线上。另外,一些基因如ndhK、rps11、rps3和rps7的点极其接近标准曲线。因此,这6个基因的SCU偏好主要受突变压力影响。然而,大多数点远离标准曲线分布,atpF、rps14、rps18和ycf2基因的点距离标准曲线最远,表明它们的SCU偏好主要受选择压力影响。总之,油茶山茶属叶绿体DNA的SCU偏好主要受选择压力影响,而一些基因的SCU偏好受突变压力影响。图4. 油茶山茶属植物叶绿体基因组中密码子的ENC作图分析表4列出了所有样本53个CDS的ENCexp值和ENCexp与ENCcobs的比值,这些比值的分布相同。表5显示了这些比值的频率分布图,反映了所有叶绿体DNA样本的遗传保守性。这些结果与图4所示结果一致。比值范围为-0.051至0.051,表5中显示的基因数量为7个,占53个CDS的13.21%。此外,clpP、ndhC、clpP和ycf3等基因的比值几乎为0,表明这些基因的SCU偏好主要受突变压力影响,上述4个基因的SCU偏好几乎完全受突变压力影响。如表5所示,其他46个基因的SCU偏好更多地受选择压力影响,ENC比率的绝对值越大。atpF、rps14和rps18基因的ENC比率在所有CDS中最高,表明它们的SCU偏好主要受选择压力影响。总之,所有13个样本及其影响因素总体上是一致的,反映了山茶属植物的遗传保守性,所有样本的SCU偏好主要受选择压力影响。然而,突变压力的影响也不能忽视。 表4. 油茶山茶属植物叶绿体基因组的ENCexp值和ENCratio表5. 油茶山茶属植物叶绿体基因组ENC ratio的频率分布图5显示了所有样本密码子的PR2作图分析结果。所有样本的图形高度相似。少数点略有偏移,ndhH、ndhK、rpl2和rpl14基因的第三密码子位置几乎均匀使用4种碱基,而atpF、ccsA、ndhA、ndhB、ndhD、rpl20、rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2、rps4、rps11、rps12和ycf3基因均匀使用A和T,atpA、atpB、petB、petD、psbB、rpl14、ycf1和ycf4基因均匀使用G和C。其他基因对4种碱基的使用不均匀,反映了所有样本叶绿体DNA的遗传保守性。53个CDS的所有点按降序分布在右下、左下、左上和右上四个象限,表明第三位置使用A少于T,使用C少于G,且A和T之间的差异大于G和C之间的差异。总的来说,所有样本的SCU偏好主要受选择压力影响,但突变压力的影响也不能忽视。 图5. 油茶山茶属植物叶绿体DNA中密码子的PR2作图分析在所有样本中筛选出高表达密码子,高州油茶、越南油茶和海南未确定种(HD01、HD02和HD09~HD13)样本的高低表达基因组中的一些密码子显示相同的ΔRSCU。其他一些样本显示的ΔRSCU值略有不同。结果详情见表6。ΔRSCU≥0.08的密码子可视为高表达密码子。在表6中标有*号的28个高表达密码子被筛选出来,其中第三位碱基为U、A、C和G的分别有11个、9个、7个和1个。因此,叶绿体DNA密码子的第三位置偏好A或T。同时,不同山茶属物种之间的SCU偏好在遗传上似乎保守。上述高表达密码子和高频密码子两者共有的包括20个最优密码子。最优密码子如下:丙氨酸的GCU和GCA,精氨酸的CGA和CGU,半胱氨酸的UGU,谷氨酰胺的GAA,甘氨酸的GGU,异亮氨酸的AUU,亮氨酸的UUA、CUU和UUG,赖氨酸的AAA,脯氨酸的CCU,丝氨酸的UCU和AGU,苏氨酸的ACU,缬氨酸的GUA和GUU,以及终止密码子UAA。在这些最优密码子中,第三位碱基为U、A、C和G的分别有11个、8个、0个和1个,而第三位碱基为C的密码子都不是最优密码子,表明所有样本叶绿体DNA中最优密码子的第三位置强烈偏好A或T。![]()
基于RSCU值构建了10个样本的系统发育树,结果如图6所示。10个样本分为6个分支(r2=0.9196,d=0.5395)。越南油茶(HD09)与广州高州油茶(HD01)的关系比广州稿子油茶(HD01)与陆川或徐闻高州油茶(HD02或HD10)更亲缘;香花油茶(HD08)与广州高州油茶(HD01)或徐闻高州油茶(HD10)、越南油茶(HD09)和海南未确定种(HD10)的关系比香花油茶(HD08)与陆川高州油茶(HD02)更亲缘。因此,这5个样本被归为同一分支。其他样本分别归为独立的分支。油茶(HD07)与多齿红油茶(HD04)、小果油茶(HD05)、南山油茶(HD06)以及高州油茶、越南油茶、香花油茶和海南未确定种(HD01、HD02、HD08、HD09和HD10)等的亲缘关系逐渐疏远,与博白大果油茶(HD03)的关系最远。 以Hartia laotica为外群,利用所有样本和另外7个山茶属物种的叶绿体DNA,基于CDS使用Bayesian方法(BI)构建系统发育树,结果如图7所示。树将所有样本的序列分为2个分支,一个包含2个子分支,另一个包含5个子分支。包含越南油茶(HD09)、高州油茶(HD01、HD02和HD13)、海南未确定种(HD10~HD12)、香花油茶(HD08)和大苞白山茶的子分支;包含南山油茶(HD06)和杜鹃红油茶的子分支;博白大果油茶(HD03)形成独立的子分支;日本油茶或者浙江红油茶的子分支包含多齿红油茶(HD04)、日本油茶和浙江红油茶;中国普通油茶子分支包含油茶(HD07)和另一株日本油茶的子分支;茶梅子分支包含茶梅和小果油茶(HD05)的子分支;以及独立的红皮糙果茶子分支。 ![]()
图7. 基于CDS使用MrBayes方法(BI)构建的13个样本的系统发育树
图6和图7显示了13个样本之间类似的关系。值得注意的是,对于高州油茶和越南油茶样本,广州高州油茶(HD01)和越南油茶(HD09)群体的节点位于最外侧,其次是这两者与海南未确定种(HD10~HD12)或徐闻高州油茶(HD13)群体的节点,最后是陆川高州油茶(HD02)群体和香花油茶(HD08)的节点。因此,越南油茶、高州油茶和海南未确定种之间的系统发育关系比广州和陆川高州油茶群体之间更亲缘,意味着越南油茶、高州油茶和海南未确定种可能是同一种,而香花油茶与它们的亲缘关系也很近。总之,由于不同物种之间的SCU偏好存在差异,可以利用这一特征来鉴定植物种类并推断它们的遗传关系。在本研究中,油茶山茶属植物叶绿体DNA密码子的第三位置与前两位置不同,显示出对A或T碱基的偏好。这一结果导致了检测到的SCU偏好,该偏好受选择压力和突变压力的综合影响,尤其是选择压力的影响。高频密码子的第三位置显示出对A或U的不完全偏好,偶尔也会出现G或C。之前的研究在不同植物中也报告了类似结果,表明叶绿体DNA在遗传上高度保守,并遵循类似规律。 本研究中使用了不同的山茶属物种,但各物种的数据高度相似,SCU偏好的特征也是一致的。主要受选择压力影响的高频密码子、高表达密码子、最优密码子和SCU偏好的基因也是一致的,表明不同山茶属物种的SCU偏好在遗传上高度保守。这一发现与之前报告的不同油茶山茶属物种的叶绿体DNA表现出良好的共线性是一致的。我们的研究小组之前报告过,油茶山茶属植物叶绿体DNA的外显子存在一些系统发育分歧热点,这些CDS的变异源于SNP位点突变。同时,第三位置的SNP突变通常是同义的,导致SCU偏好。因此,SCU偏好可用于物种的进化分析。事实上,基于SCU偏好和CDS的进化分析结果是一致的,本研究中基于RSCU值和CDS为10个样本构建了两棵相似的系统发育树。这些结果与基于全长叶绿体DNA构建的系统发育树一致,后者的结果与本文所述样本相关。高州油茶、越南油茶、海南未确定种和香花油茶之间的关系是一致的,并暗示将越南油茶和高州油茶合并为一个物种。海南未确定种是越南油茶,但香花油茶是否为独立物种还需要进一步的遗传证据。博白大果油茶被分为独立的分支也是一致的。因此,所有与SCU偏好、CDS和全长叶绿体DNA相关的结果都可用于区分物种,并可揭示不同油茶山茶属物种之间的遗传关系。以前的研究显示,油茶叶绿体DNA有18个最优密码子,这与本文的发现不一致。此外,由于17个最优密码子是一致的,因此筛选出3个最优密码子(UUA、CGA和UCU),而未观察到最优密码子GAC。这种差异的原因可能是高/低表达基因组的定义存在差异,或者是叶绿体DNA测序存在错误。这个问题需要在进一步的研究中解决,以促进叶绿体DNA基因表达的研究和叶绿体DNA基因工程的发展。在本研究中,通过对大量数据的详细分析确定了SCU偏好与特定基因之间的关联,然后确认了这些特定基因的密码子组成和SCU偏好,这与之前普遍忽略特定基因的研究不同。揭示了一些特定基因的密码子组成模式,并确认了一些特定基因SCU偏好的决定因素。 本文揭示了一些特定基因的SCU偏好,这将支持进一步研究油茶叶绿体DNA基因表达的调控和油茶叶绿体DNA基因工程的发展。在本研究中,SCU偏好可用于区分物种并揭示油茶不同种类之间的遗传关系,表明SCU偏好反映了物种特异性,可用于构建油茶种质资源鉴定技术体系。在油茶叶绿体DNA中,只有极少数基因表现出均匀的碱基组成;相反,绝大多数基因的密码子表现出对A或T的偏好,第三位表现出对A或T的强烈偏好,第三位的碱基决定了SCU偏好。油茶的SCU偏好较弱,受选择压力的影响;同时,突变压力的影响也不能忽视,37.74%的密码子表现出受突变压力影响的SCU偏好。在油茶叶绿体DNA中,筛选出30个高频密码子、28个高表达密码子和20个最优密码子,这些密码子的第三位碱基显示出对A或U的显著或强烈偏好。确认了油茶叶绿体DNA密码子组成和SCU偏好的特征,这可以支持油茶叶绿体DNA基因表达调控的研究和油茶叶绿体DNA基因工程的发展。由于油茶叶绿体DNA的SCU偏好在遗传上高度保守但具有种特异性,因此叶绿体DNA的RSCU值可用于油茶种质资源的种鉴定。研究结果建议将越南油茶和高州油茶合并为一个物种，并认为海南尚未确定的物种是越南油茶。但确定香花油茶是否为独立种还需要进一步的遗传证据。
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